【摘 要】
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冬荪具有很高的食用价值和药用价值,未见其菌丝体发酵培养代谢物组成和关系研究。为了深入了解冬荪菌丝体胞外代谢物组成,本文采用液体深层发酵培养技术分析了不同发酵时间菌丝体分泌物差异情况及其关系,根据生物信息学分析结果确定冬荪胞外组分标志物水苏糖并根据KEGG推测其代谢通路。另外从底物代谢调控和转录因子表达共同解析水苏糖代谢通路,为冬荪多糖代谢途径的调控研究提供参考。本文研究结果如下:1.菌株鉴定。IT
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冬荪具有很高的食用价值和药用价值,未见其菌丝体发酵培养代谢物组成和关系研究。为了深入了解冬荪菌丝体胞外代谢物组成,本文采用液体深层发酵培养技术分析了不同发酵时间菌丝体分泌物差异情况及其关系,根据生物信息学分析结果确定冬荪胞外组分标志物水苏糖并根据KEGG推测其代谢通路。另外从底物代谢调控和转录因子表达共同解析水苏糖代谢通路,为冬荪多糖代谢途径的调控研究提供参考。本文研究结果如下:1.菌株鉴定。ITS序列TA克隆测序结果表明,序列峰图显示均为单峰,峰型清晰独立且完整,菌株碱基总长594bp,GC含量为51%。以Mutinus zenkeri KC128650为外群,用最大似然法构建系统发育树,结合菌株宏观形态学,可知供试菌株P1710141为冬荪（Phallus dongsun）。2.不同发酵期代谢物分析。UHPLC-MS/MS分析结果表明,共筛到534种代谢物,有机酸类化合物占比为17.978%是发酵环境成酸性的主要原因。共筛选出大豆苷,水苏糖,反式-4-羟基-L-脯氨酸,UDP-Glc NAc等37种特征代谢物,差异代谢物显著富集在ABC转运蛋白、c AMP信号通路、半乳糖代谢等86条代谢途径,并推测了冬荪水苏糖等胞外多糖的合成路径,对鬼笔属真菌胞外多糖研究具有指导意义。研究发现,不同发酵时间代谢物种类和数量远高于已研究报道的子实体和菌丝体化学成分,对多角度研究鬼笔属真菌活性成分具有指导意义。3.糖类代谢物含量的检测方法建立。建立了冬荪发酵液基于HPLC-ELSD检测糖类代谢物含量的方法,即聚合物氨基色谱柱（Asahipak NH2P-50 4E）,流动相（乙腈:水,62:38）,进样量为3μL,柱温设置为40℃,增益20倍,0.5MPa作为压强参考值,漂移管温度以60℃最佳,最适流速0.5m L·min-1。4.代谢物转录组分析。对数期、稳定期和自溶期转录本有效长度分别是6.57G、5.78G和5.84G,共注释27426条Unigenes。差异基因和差异代谢物关联分析表明,氨基酸生物合成,以及脂肪细胞脂解代谢等途径显著富集,芳香族、氨基酸家族代谢过程是冬荪发酵过程中菌香味变化的原因。根据对数前期到对数末期c AMP和DL-乳酸含量变化,推测RP-S6e和CCNB1是冬荪菌丝体发酵对数期相变的主要调控因子,MHC-Ib类对冬荪发酵自溶期细胞代谢起到抑制作用。5.水苏糖代谢通路初步解析。对冬荪水苏糖代谢通路解析可知,菌丝体对数生长期水苏糖以合成为主,棉子糖和蔗糖可以转化合成水苏糖,棉子糖浓度为600mg/L时抑制表达,蔗糖处理浓度为15g/L促进水苏糖上调表达。菌丝体生长自溶期,GLA上调表达显著,α-半乳糖苷酶催化水苏糖水解为棉子糖和葡萄糖,水苏糖通过Msm K、葡萄糖通过Agl K催化ATP水解产生能量实现菌丝体细胞跨膜运输。从底物和转录因子两个方面解析了冬荪水苏糖合成途径。
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