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果胶类物质是非淀粉多糖重要组成成分之一,主要分布在植物细胞壁的中胶层中,由不同酯化度的多聚半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成。果胶类物质虽然不能直接向动物体提供能源,但是它有很好的益生作用,可以影响很多物质的代谢。果胶类物质也是重要的可再生资源,其降解的半乳糖醛酸寡糖产物具有高利用价值。 果胶酶是降解果胶类物质的一类复合酶的总称。按照降解底物、作用方式等可以将果胶酶分为三类:通过水分子的参与攻击α-1,4糖苷键的聚半乳糖醛酸酶,通过反式消去作用断裂糖苷键的果胶裂解酶以及可以降解酯化果胶的果胶酯酶。果胶酶具有广阔的应用前景,可以应用于食品、纺织、饲料、造纸等行业,因此发掘更多的具有不同优良性质的果胶酶具有重要的意义。 本论文从嗜热真菌Neosartorya fischeri P1中克隆获得了一个内切聚半乳糖醛酸酶基因(Nfpg5)以及两个外切聚半乳糖醛酸酶基因(Nfpg4和Nfpg6)。为验证其生物学功能,分别构建了重组表达载体,并成功在毕赤酵母中表达。NfPG4的氨基酸推导序列与来源于N.fischeri NRRL181的XM_001257488.1序列一致性为97.6%,与已完成性质测定的Aspergillus tubingensi外切聚半乳糖醛酸酶序列最高一致性为79%。重组酶NfPG4,最适温度65℃,在55℃条件下处理1h可以保持稳定;最适pH3.5,在pH3.0-8.5范围内,37℃处理1h表现较好的稳定性。Km值为2.9 mg/ml,kcat为720 s-1,比活为700.9 U/mg。NfPG5的氨基酸推导序列与N.fischeri NRRL181的XM_001264034.1序列一致性为100%,与已报导且经过性质测定的Achaetomium sp.Xz-8内切聚半乳糖醛酸酶序列最高一致性为58%。重组酶NfPG5的最适温度为70℃,在55℃条件下处理1h可以保持稳定;最适pH4.5,在pH2.0-11.0范围内,37℃处理1h表现较好的稳定性。Km值为1.0 mg/ml,kcat为2854 s-1,比活为3630.4 U/mg。NfPG6的氨基酸推导序列与N.fischeriNRRL181的XM_001263571.1序列一致性为100%。重组酶NfPG6,最适温度55℃,在50℃条件下处理1h可以保持稳定;最适pH4.5,NfPG6在pH2.0-11.0范围内,37℃处理1h表现较好的稳定性。Km值为3.4 mg/ml,kcat为724 s-1,比活为53.9 U/mg。 综上所述,本论文通过基因克隆的方法从嗜热真菌N.fischeriP1中获得了三个具有优良性质的新果胶酶,其中NfPG4和NfPG5具有高温高催化效率的特性,在高温工业领域中有重要的应用潜力。