肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见恶性肿瘤,发病率居世界第六,肿瘤相关死亡率居世界第三。据估计,全世界每年新诊断病例约五十万人,统计显示,发展中国家患病率较发达国家更高。早期肝细胞癌的治疗方法有外科手术切除、经皮肝穿刺消融术和肝移植等。然而,对于进展期肝细胞癌,治疗方法有限,且五年生存率极低。肝细胞癌的发生发展是一个非常复杂的过程,与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及血管生成有关,涉及许多分子变化及信号通路,越来越多的证据表明,基因的异常表达或突变与肝细胞癌的发生发展及预后有关,包括癌基因(如CCND1、EGFR、c-myc和Ras等)以及抑癌基因(如p53、GSTP1、p16、RIZ1等)突变。肿瘤转移和复发是HCC预后不良的主要原因,但是HCC的发生及转移的具体机制仍未明确,因此探索其预后相关分子标记具有十分重要的意义,亦有助于为临床治疗提供更多方法。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一种病理状态,指因外环境改变,抑制维持上皮细胞形态的基因,上调表达肌成纤维细胞的基因,细胞丧失原有的上皮特征,从而转变为间充质表型。在这个过程中,上皮标记减少,细胞间黏附作用下降;并出现了间充质标记,从而具备了迁移特性以及分泌功能。肿瘤细胞的EMT是肿瘤进展的主要机制之一。Twist属于原始螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族,是与胚胎发育和肿瘤转移相关的转分化程序EMT的关键诱导剂之一,在调节EMT过程中起着举足轻重的作用。从机制上讲,Twist与E-box的结合可以通过转录抑制E-cadherin的表达,从而破坏细胞间粘附并诱导单个癌细胞从原发部位播散,进一步导致间充质标志物的激活和随后诱导的细胞侵袭。XBP1(X-Box Binding Protein 1)是一种参与内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激反应的分子,能够使细胞在不利条件下存活。XBP1被非常规的剪接机制激活,具有两种形式:剪接型XBP1s和非剪接型XBP1u,XBP1s由XBP1u经剪切后形成。XBP1u非常不稳定,而XBP1s的半衰期较长,转录活性远高于前者。已经发现XBP1蛋白在肿瘤细胞中异常高表达,但XBP1在HCC进展中的作用尚不清楚。我们发现HCC细胞系和组织样本中XBP1s的表达高于对照细胞和组织样本,临床病理分析表明XBP1s的表达与远处转移和预后不良密切相关,体内和体外实验也证实XBP1s的过表达促进了HCC细胞中的EMT和转移,XBP1s的沉默减弱了细胞迁移和体外EMT表型的发展,通过进一步研究发现,在HCC细胞中,XBP1s增强了Twist和Snail的表达,导致促进细胞粘附作用的E-cadherin的表达减少,阐明HCC细胞中XBP1s促进EMT的分子机制,证实XBP1s可以介导Twist的表达。综上所述,这项研究揭示了一个新的XBP1s/Twist/Snail通路,可以介导EMT在HCC细胞中的表达及HCC的侵袭转移。本课题分为四部分,研究了XBP1s在HCC细胞系与HCC组织中的表达情况,及其表达水平与HCC的预后之间的关系,探讨了该基因在促进HCC的侵袭和转移中的作用及具体机制,并提出下一步研究的方向。第一部分XBP1s在HCC组织和细胞系中的表达研究目的:研究XBP1s在HCC细胞系和正常肝细胞之间表达的差异,进一步研究XBP1s在HCC组织及癌旁组织中的表达及其与预后的关系。研究方法:1.采用免疫印迹分析、免疫荧光分析及qRT-PCR分析XBP1s在正常肝细胞系(QZG)和四种HCC细胞系中的表达;2.采用免疫印迹分析、免疫组化及qRT-PCR分析HCC患者癌组织及癌旁组织中的XBP1s表达水平。结果:1.免疫印迹分析及qRT-PCR研究表明,所有四种人类HCC细胞系中XBP1s的表达显著高于QZG细胞(p<0.01);免疫荧光分析显示,与QZG细胞相比,XBP1s在HepG2细胞中显著增加,并且XBP1s的染色模式主要位于肝细胞的细胞核中;2.免疫印迹分析及qRT-PCR研究证实,HCC组织中XBP1s的表达显著高于癌旁组织(p<0.05);免疫组织化学显示,XBP1s主要位于肝细胞核内,XBP1s在HCC组织中的阳性表达率(79/103例,76.7%)显著高于癌旁组织(20/103例,19.4%)(p<0.05),XBP1s的过度表达与肿瘤大小(p=0.028)、肝内转移(p=0.003)和远处转移(p=0.039)密切相关,但与性别、年龄、甲胎蛋白、HBV感染无显著相关性。结论:XBP1s在HCC细胞中的表达量明显高于正常肝细胞系;XBP1s在临床HCC组织中的表达增加,且与远处转移有关。第二部分XBP1s促进HCC细胞的侵袭和转移研究目的:研究XBP1s在HCC细胞的侵袭和转移中的作用。研究方法:1.采用基质胶侵袭实验测定XBP1s转染的HCC细胞SMMC-7721和HepG2的侵袭能力;2.通过细胞划痕实验,比较HepG2/XBP1s和HepG2/GFP细胞之间的细胞迁移率,分析XBP1s转染的HCC细胞的迁移能力;3.裸鼠尾静脉注射XBP1s-HepG2细胞,用空载体转染细胞作为对照,进行裸鼠体内肿瘤的转移测定。结果:1.基质胶侵袭实验显示,与空载体转染的细胞相比,XBP1s转染的HCC细胞的侵袭能力显著增加(p<0.05);2.细胞划痕实验显示,XBP1s的过表达增加HCC细胞迁移能力(p<0.05);3.裸鼠的转移实验显示,与对照组相比,注射XBP1s-HepG2细胞的裸鼠在肺中检测到的微转移病灶数目显著增多(p<0.05)。结论:XBP1s可增强HCC的侵袭和转移能力。第三部分XBP1s促进HCC细胞的EMT研究目的:研究XBP1s与HCC细胞EMT的关系。研究方法:1.采用免疫印迹法分析XBP1s、上皮标记(E-cadherin,γ-catenin)和间充质标记(Vimentin)在转染XBP1s的HepG2细胞中的表达;2.采用免疫荧光染色,观察XBP1s的上调与HepG2细胞中E-cadherin,γ-catenin和Snail的表达之间的关系;3.采用免疫印迹法检测HCC组织样本中XBP1s、E-cadherin和Vimentin的表达。结果:1.免疫印迹结果显示,XBP1s过表达的细胞中间充质标记Vimentin的表达增加,而表皮细胞标志物E-cadherin和γ-catenin降低(p<0.05);2.免疫荧光结果显示,与对照细胞相比,XBP1s过表达的细胞中,间充质标记Snail的表达明显增加,而表皮细胞标志物E-cadherin和γ-catenin降低(p<0.05);3.线性分析显示,在HCC组织中,XBP1s的表达与Vimentin呈正相关(p<0.001),与E-cadherin表达呈负相关(p<0.001);进一步分析XBP1s的表达和表皮-间充质标志物的关系,在XBP1s高表达的HCC样本中,Vimentin的高表达和E-cadherin的低表达分别为66.7%和64.5%,而在XBP1s低表达的HCC样本中,Vimentin的高表达和E-cadherin的低表达仅为11.1%和18.2%,两组结果具有显著性差异(p<0.05)。结论:XBP1s可促进HCC细胞的EMT。第四部分XBP1s通过Twist/Snail途径调控HCC细胞的EMT研究目的:研究XBP1s可否激活Twist/Snail通路,并进一步调控HCC细胞的EMT。研究方法:1.采用免疫荧光染色研究XBP1s在HepG2细胞中是否上调Twist表达;2.采用免疫印迹法进一步明确XBP1s是否诱导Twist及其下游基因表达;3.采用Twist启动子萤光素酶报告基因法分析XBP1s诱导的Twist转录激活;4.采用免疫印迹法进一步研究XBP1s是否通过Twist/Snail通路参与HCC细胞的EMT。结果:1.免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,XBP1s转染的HepG2细胞中Twist表达水平显著增加;2.免疫印迹结果显示,与相应的对照组相比,XBP1s转染的HepG2细胞中,XBP1s表达显著增加,同时Twist和Snail显著增加,而E-cadherin表达显著降低;而XBP1s-siRNA转染的HepG2细胞抑制Twist和Snail表达,同时上调E-cadherin表达;3.萤光素酶报告结果显示,与Twist野生型启动子载体相比,(-14至-20)突变型载体转染的HepG2细胞中的荧光素酶活性显著降低(p<0.01);4.免疫印迹结果显示,Twist siRNA可有效抑制Twist的表达,Snail siRNA可有效抑制Snail蛋白的表达,并能部分逆转XBP1s诱导的EMT表型。结论:在HCC组织和肝细胞中,XBP1s通过XBP1s/Twist/Snail依赖途径诱导HCC细胞EMT,并促进HCC的侵袭和转移。