论文部分内容阅读
背景外伤事故、肿瘤切除、退行性疾病导致骨骼肌损伤,会造成大面积骨骼肌缺损(VML),发病率较高,治疗方法却有限。虽然人体骨骼肌在损伤后有强大的再生能力,但是这种再生反应依赖肌肉损伤的严重性[1-3]。一般来说,如果超过20%肌肉的丧失,那么自然修复过程就会失败,并且导致疤痕组织形成,缺损处远端肌肉去神经化[1-3],导致功能丧失。明显,需要更好的治疗方法,当骨骼肌受到创伤时,可以促进骨骼肌自身修复和再生,并且能够诱导肌肉的合成功能。把干细胞接种到全器官脱细胞基质中,获得组织工程肺、肝和心脏以供活体植入,是能够实现的。骨骼肌占到了人体的40-50%,肌肉骨骼的创伤,包括大面积缺损,是很常见的。由于骨骼是功能单一的器官,通过把干细胞接种到骨骼肌支架(ECM),来获取组织工程肌肉应该比较容易。最近的研究表明,来源于同源组织的肝脏和肺脏生物学支架可能比非特异组织更加适合于组织重构。迄今为止,人们已经多次尝试对骨骼肌ECM进行脱细胞,但至今尚未报道获得完整的带有血管网的细胞外基质。来自器官脱细胞的细胞外基质(ECM)补片有广阔的前景,将会越来越多的生物材料应用到组织工程领域。骨骼肌脱细胞基质很少被报道及描述,骨骼肌细胞外基质(PM-ECM)修补大面积肌肉缺损的生物活性及功能还不是很清楚。在目前研究中,PM-ECM来源于腹直肌(RA),猪的腹直肌灌注脱细胞技术能够有效的将细胞及重要物质分离出去,并且保留原有腹直肌复杂的三维结构和血管网络,且保留了部分生物活性物质及机械性能。我们为什么选择猪的腹直肌作为原材料,先看下猪腹直肌的解剖。(1)腹直肌结构:腹直肌常被用作肌肉瓣、肌皮瓣、带蒂皮瓣瓣或游离瓣,不受大小或形态的限制,这使得它具有了大量的临床用途,包括乳房切除术后的重建,胸壁重建,咽部或食道重建,局部晚期软组织肉瘤切除后的重建,头部和颈部区域的重建手术。腹直肌是相对独立的骨骼肌,其周围环绕着腹直肌鞘,血供丰富(图1,2)。腹直肌的动脉血管是由腹壁上动脉(位于第七肋骨处的胸廓内动脉的分支)和腹壁下动脉(髂外动脉的分支)组成的。腹壁下动脉支配经腹直肌和后鞘,在脐部分成若干支血管与腹壁上动脉汇合。4、5肋间动脉后方的末端分支和腰动脉以及腹壁下动脉之间,也有血管的汇合。按照解剖学的观点,猪的腹直肌与人的十分相似,包括周围的结构和内部血管的分支方式。(2)腹直肌的结构和血管:最小的收缩单位是肌纤维,它是圆柱形的、多核、肌小管组成(图3).每一束肌纤维被肌内膜包裹,大约20-80个平行肌纤维裹在一起形成肌束或纤维从,被肌束膜包裹,它比肌内膜厚,肌肉由很多肌束形成,外面被外在的胶原覆盖,称为肌外膜。肌肉的主要血管沿长轴分布,滋养血管从右侧或斜面从主干血管进入肌外膜,小动脉进入肌束膜后垂直进入肌纤维,发出终末血管进入肌束膜后成为毛细血管,无数的毛细血管嵌入肌内膜,供应平行的肌纤维。毛细血管在肌肉中直径大约4um,毛细血管后静脉管径稍粗,不是来源伴行的静脉,而是来之动脉。目的从猪的腹直肌(RA)灌注脱细胞得到PM-ECM支架;比较PM-ECM与SIS材料的理化特性,完成体外种植C2C12细胞试验评估;建立SD大鼠腹壁缺损模型,比较PM-ECM与SIS补片的修复效果,重点在于组织的重构、血管再生及生物相容性,为寻求理想的生物材料提供实验依据。材料和方法第一部分:猪的腹直肌(RA)灌注脱细胞基质PM-ECM支架的制备及评估1.完成猪腹直肌取材,按灌注脱细胞的流程制备腹直肌脱细胞基质(PM-ECM)。2.制备SIS补片3.检测PM-ECM中DNA、SDS、GAG、b FGF、EGFR的含量,与SIS补片进行比较,免疫组化实验标识层连接蛋白、IV胶原蛋白、纤维连接蛋白,电镜下观察基质三维结构,检验PM-ECM脱细胞的彻底性。4.检测PM-ECM的生物力学情况。第二部分:PM-ECM支架体外生物活性检测及评估1.体外C2C12种植PM-ECM、SIS降解产物培养基上,小室法观察在不同基质浓度下C2C12迁移情况。2.比较C2C12细胞在PM-ECM、SIS降解产物培养基中的分化及增殖情况3.使用Alamar-blue法观察C2C12细胞在PM-ECM、SIS表面的代谢情况。第三部分:PM-ECM、SIS修复大鼠腹壁缺损模型的效果及评估1.将36只SD大鼠随机分成6组,每组6只,人为制造腹壁缺损模型,分别采用PM-ECM、SIS修补缺损,设置空白对照。2.术后观察有无死亡,有无无伤口破裂或手术部位感染。无修复区腹壁松弛或瘘管形成。3.第2周、8周分别处死,观察有无血清肿发生,切下修复区的标本送组织切片,观察修复区域肌纤维、血管、神经细胞的再生情况以及补片的皱缩及松弛情况。结果1.骨骼肌灌注脱细胞彻底,SKWOACM的组织学和扫描电镜检查均未见任何细胞结构和成分,DAPI染色阴性;在完全冷冻干燥的PM-ECM中DNA含量低于500ng/mg,据此计算天然骨骼肌中99.5%的DNA已被清除;残留DNA均为短链DNA(200-500bp);符合脱细胞金标准。(2)无残留化学物质、消毒灭菌不影响其生物学特性。(3)保留了天然骨骼肌细胞外基质三维平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌内膜超微结构,骨骼肌基底膜贴附于肌内膜内面。(4)保留有主干血管和毛细血管网络,可见终末动脉和伴行的2条终末静脉;组织结构完整,内部的血管基质网络能耐受经支配血管灌注的300mm Hg高压液体而仅有远切端少许渗漏。(5)保留有脱细胞的肌肉-肌腱接头结构,可直接传导力学。(6)PM-ECM保留有多种生物活性成分:免疫组化染色证实PM-ECM中含有骨骼肌基底膜主要成分蛋白如IV型胶原、层连蛋白、纤维连接蛋白。(7)PM-ECM可制成多种形式衍生物,包括薄片、微粒、流体化组合物、凝胶;生物力学测试,PM-ECM的极限抗拉强度类似于天然肌肉,PM-ECM相比SIS具有更大抗拉强度。2.PM-ECM浓度为50μg/ml时即达到促成肌细胞趋化最佳效果、在浓度50μg/ml时即达到促成肌细胞增殖和分化最佳效果,体外实验结果PM-ECM组优于SIS组,同时也证明PM-ECM降解产物在体外能促进成肌细胞的分化、增殖及代谢活动。3.PM-ECM、SIS修复大鼠腹壁缺损模型(VML),通过观察生物补片修补血清肿发病率高,PM-ECM修补区域的在新生血管生成、肌纤维生长、神经纤维细胞生成、肌肉再生以及补片皱缩方面都优于SIS补片,PM-ECM具有良好的生物安全性,证实PM-ECM在大鼠体内修复腹壁缺损是安全、可行的。实验结论1.骨骼肌血管灌注脱细胞彻底;PM-ECM保留了天然骨骼肌细胞外基质三维平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌内膜超微结构;保留了GAG、b FGF、EGFR等生物活性因子;2.PM-ECM体外评估实验,观察C2C12细胞在PM-ECM、SIS降解成分的培养基中迁移、分化及增殖过程,PM-ECM浓度为50μg/ml时即达到促成肌细胞趋化最佳效果、在浓度50μg/ml时即达到促成肌细胞增殖和分化最佳效果,体外实验结果PM-ECM组优于SIS组,同时也证明PM-ECM降解产物在体外能促进成肌细胞的分化、增殖及代谢活动,C2C12细胞在体外能够在PM-ECM表面分化及增殖。3.PM-ECM具有良好的生物安全性PM-ECM基质修复效果优于SIS补片,具备良好的组织相容性。创新点1.使用灌注法骨骼肌全器官脱细胞技术,保留了细胞外基质的三维微循环结构。2.骨骼肌全器官脱细胞补片修复腹壁缺损,为3-D生物材料修复提供了基础。