人ITSN2基因新剪接异构体的克隆和鉴定

来源 :湖南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chongzimm
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Intersectin家族成员ITSN1和ITSN2,都是有广泛表达的蛋白。它们都有2个EH结构域、一个CC结构域和5个连续的SH3结构域,通过选择性剪接具有2个主要的转录本。一个短的转录本S和一个在C端依次增加了编码DH、PH和C2结构域的长转录本L。相对于ITSN1,ITSN2在组织表达中更有普遍性。研究表明ITSN主要在网格蛋白介导的内吞过程中起到支架蛋白的作用。   TNFAIP1是一个受肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导表达的即早基因,为了研究TNFAIP1的相互作用蛋白,我们以TNFAIP1为诱饵蛋白,使用酵母双杂交技术筛选人的胚胎脑库,结果筛选出了ITSN2基因的一段,主要包含EH2和CC两个结构域。为了进一步研究它们之间的相互作用,我们首先克隆了ITSN2。先克隆前、中、后三部分再连接起来得到ITSN2全长,测序结果显示相对于ITSN2-L缺失了了17号外显子和36号外显子的一部分。我们将这一新剪切体命名为ITSN2-M。分析显示ITSN2-M的前期读码结构没有改变,但在36号缺失后产生了一个终止密码子。因为17号外显子的缺失,位于中间的CC结构域被破坏;而36号外显子缺失导致翻译终止,影响了PH和C2结构域。说明这种不同于ITSN2-L的转录本,具有不同的结构域,而与蛋白相互作用的结构域的改变可能使ITSN2-M结合不同的蛋白,从而行使不同的功能。   我们用实验确定了在ITSN2-M中,17号外显子和36号外显子是同时缺失的。分别提取HeLa、293FT、MCF7和Pancl细胞的RNA反转录成cDNA,以此为模板进行反转录PCR检测外显子缺失情况,都有17号和36号外显子缺失。我们用ITSN2的EH和CC结构域段作为抗原,注射兔子得到兔子抗EC的抗体。分别用细胞免疫荧光和WesternBolt检测了抗体的特异性。用EC抗体在293FT、HeLa、SK-SN-SH细胞和人正常胚胎的脑、脑干组织中检测ITSN2蛋白的表达。其中ITSN2-M在正常脑和脑干中表达很高,但是在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中表达量很低。这可能说明ITSN2-M在神经细胞中具有重要的生理学作用和功能。
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