论文部分内容阅读
目的：通过探究TGF-β1在犬穿透性角膜移植术(PKP)后在角膜中的表达变化规律并运用TGF-β1蛋白滴眼液点眼,来探索TGF-β1对角膜免疫排斥反应的影响。方法：(1)选取22只本地杂交犬随机分为2组,分别为生理盐水点眼组和供体组,每组9只,余下3只备用。PKP术后试验犬每日生理盐水点眼4次,每次点2滴。每日裂隙灯观察,根据Larkin评分标准记录免疫排斥反应发生时间。(2)选取35只本地杂交犬随机分为2组,分别为生理盐水点眼组,供体组,每组15只,余下5只备用。在生理盐水点眼组试验犬PKP术后1d,3d,7d和14d使用RT-PCR方法测量角膜中TGF-β1的表达量变化。(3)选取59只本地杂交犬随机分为3组,分别为TGF-131点眼组,生理盐水点眼组,供体组,每组18只,余下5只备用。TGF-β1点眼组于PKP术后每日点4次TGF-β1蛋白浓度为50p1/ml的滴眼液,每日3次,生理盐水组以相同点眼方式点眼生理盐水,根据Larkin评分标准记录免疫排斥反应发生时间,并于术后3d,7d和14d,取角膜组织制作HE染色切片。试验结果：(1)生理盐水试验组在角膜移植术后的第5d发生2例排斥反应,术后第6d发生3例排斥反应,术后第7d发生3例排斥反应,术后8d发生1例排斥反应,角膜植片免疫排斥反应的平均时间为6.7±1.3天。(2) RT-PCR得到的数据处理采用相对定量的△△ACt法,根据各个基因的标准曲线,通过测试样的CT值得到相对应的数据,以此比较。TGF-β1表达量在术后1d为2.4倍,,术后3d为2.9倍,此时的表达量为整个检测时间点中的最高峰值。TGF-β1表达量在术后3d以后呈现递减的趋势,术后7d为0.75倍,直到术后14d为最低值0.5倍。(3)在TGF-β1液滴定术眼试验中,用生理盐水滴眼的对照组,在角膜移植术后的5d发生两例排斥反应,术后6d发生4例排斥反应,术后7d发生5例排斥反应,术后8d发生3例排斥反应,最后两例于术后第9d发生。使用TGF-β1蛋白滴眼液的实验组于角膜移植术后11d发生第一例排斥反应,术后12d发生一例排斥反应,术后13d发生3例排斥反应,术后14d发生5例排斥反应,术后15d发生3例排斥反应,术后17d发生一例排斥反应,最后一例排斥反应发生于术后19d。TGF-β1蛋白滴眼液点眼的试验组的角膜植片存活的平均时间为13±2.1d,使用生理盐水点眼的对照组的角膜移植片存活平均时间为7±1.3d,试验组角膜植片的存活时间很显著的长于对照组,差异显著(P<0.01)。(4)使用裂隙灯对穿透性角膜移植术后的植片进行临床观察并拍照记录,PKP术后3d观察角膜植片,生理盐水对照组的植片出现轻度的角膜水肿,裂隙灯光能透射前房,TGF-β1蛋白滴眼液点眼试验组的植片均呈现比较好的透明度,植片周围的植床呈现轻度的角膜水肿,裂隙灯光能透射前房。两组均未发生免疫排斥反应。PKP术后7d观察角膜植片,生理盐水对照组的植片有11例已经完全失去透明度,角膜严重增厚,植片周围有新生血管爬行。TGF-β1蛋白滴眼液试验组的角膜植片呈现中度水肿,裂隙灯光部分能透射前房,缝合处有少量新生血管爬行,试验组尚未发现免疫排斥反应的发生。PKP术后14d,生理盐水对照组所有植片重度水肿,植片完全失去透明度。TGF-β1蛋白滴眼液试验组的植片有10例发生免疫排斥反应,裂隙灯光无法穿透前房,瞳孔尚可见,角膜重度水肿。生理盐水对照组术后3d的组织切片观察可见,内皮层有部分缺失,基质胶原细胞排列有序,基质层轻度水肿,上皮层略有损伤。术后7d的组织切片观察可见,内皮层脱落,基质层中度水肿,上皮层部分缺失或脱离基质层。术后14d的组织切片观察可见,内皮层完全脱落,后弹力层部分缺失,上皮层部分缺失,基质层严重水肿；TGF-β1试验组术后3d的组织切片观察可见,角膜上皮细胞完成,排列有序,基质层无明显水肿,内皮细胞完整。术后7d,内皮细胞仍然附着于后弹力层但内皮细胞数量减少,上皮层完成,上皮细胞排列有序。术后14d,内皮细胞脱落,基质层中度水肿,上皮细胞完整。结论：(1)TGF-β1作为滴眼液能有效抑制免疫排斥反应。(2)TGF-β1的低表达与免疫排斥反应的发生有关