论文部分内容阅读
【研究背景及目的】2000年代初,新发现的属于CD4~+T细胞的一个独特的亚群--Th17细胞,其功能和作用等方面均不同于其他CD4~+T细胞亚群如Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞,Th17细胞在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义,包括类风湿关节炎、多发性硬化、脑脊髓炎、结肠炎和银屑病等等。Th17细胞能够分泌产生IL-17A、IL-17F、IL-6、以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factora,TNF-α),这些细胞因子通过募集活化中性粒细胞,而有效介导组织炎症过程,当这种保护作用过度时,则可能导致自身免疫的发生。Th17细胞具有炎症性,其特征是能够表达特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体(Retinoid-related orphan receptor gammat,RORγt),并分泌关键的细胞因子白介素17(IL-17A)。IL-17是Th17细胞的主要效应因子,具有强大的招募中性粒细胞的前炎细胞因子性质,能够促进多种细胞释放炎症因子。维甲酸相关孤儿核受体(Retinoid-related orphan receptor gammat,RORγt)是Th17细胞特异性核转录因子,它能够和其他转录因子一起协同促进Th17细胞的分化,过表达RORγt可以诱导Th0向Th17细胞方向分化;它可以诱导编码IL-17和IL-17F细胞因子基因的表达,通过结合IL-17启动子直接激活IL-17的转录以及其他转录因子一起协同促进Th17细胞的分化。日本血吸虫主要分布于东南亚地区,是我国主要的卫生问题,日本血吸虫病属于人畜共患病。日本血吸虫感染机体后,可以特异性地诱导Th17细胞及其高分泌的细胞因子IL-17的产生,Th17细胞通过其主要表达产物IL-17在血吸虫感染免疫中发挥重要作用。p300蛋白是组蛋白乙酰化转移酶HATS家族成员之一,具有乙酰化功能,就乙酰化而言,它能够对组蛋白进行乙酰化修饰,也能够对一些转录因子进行乙酰化修饰,其中通过修饰转录因子可以影响蛋白质稳定性,亚细胞定位和DNA的结合能力,参与细胞分化、转录、免疫应答等调控。课题组前期研究结果发现,p300是通过与RORγt的第81位赖氨酸残基结合,从而乙酰化RORγt,p300通过对RORγt的这种乙酰化作用,促进了RORγt与IL-17启动子结合从而上调其介导的IL-17的转录,从而正向调控Th17细胞的分化。综上所述,我们提出假设,是否可以通过抑制p300对RORγt的乙酰化作用来抑制Th17细胞的分化增值,从而抑制日本血吸虫感染引起的自身免疫性疾病的发生发展,带着这个疑问,我们查阅大量文献找到了一种有效的乙酰化转移酶抑制剂JQ1,它能够竞争性结合到BRD4的乙酰化-赖氨酸残基,于是我们推测JQ1能够抑制乙酰化转移酶p300来完成以上提出的假设,为了证明此推测成立,我们进行一系列体内体外实验验证,另外,JQ1与p300的哪部分结构域的有效结合来抑制p300的乙酰化效应也成为我们实验探究目的的一部分。【研究方法】1.HEK293T细胞中,共同转入Myc-RORγt和Flag-p300质粒,JQ1处理后再通过免疫共沉淀、免疫沉淀和Westernblot检测蛋白之间相互作用和蛋白质乙酰化反应。2.从人脐带血中分离出人脐血单个核细胞,然后磁珠分选出Na?ve T细胞,诱导分化得到人Th17细胞,流式细胞术和qPCR检测分析人Th17细胞的诱导分化;用JQ1处理后,免疫共沉淀和Western blot分析检测蛋白质相互作用和蛋白质乙酰化反应。3.采用qPCR技术检测经过JQ1处理后人Th17细胞效应因子mRNA的表达。4.采用酶联免疫吸附实验ELISA检测分析人Th17细胞中JQ1是否对Th17细胞上清中IL-17表达有抑制作用。6.制备日本血吸虫尾蚴感染小鼠模型,流式细胞术检测小鼠肝脏肉芽肿细胞中JQ1是否抑制IL-17~+和RORγt~+T细胞的表达,采用HE染色和天狼星红染色观察肝脏病理改变。7.乙酰化转移酶酶活试剂盒检测JQ1是否抑制p300的HAT和BRD+HAT两段结构域的乙酰化转移酶活性。【研究结果】1.共转染p300和RORγt质粒的HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示,与DMSO溶剂对照组相比,JQ1处理组RORγt乙酰化降低,乙酰化程度随着JQ1浓度增加呈现出浓度梯度降低现象。2.人Th17细胞诱导分化成功,并且Westernblot结果显示出与DMSO溶剂对照组相比JQ1处理组中RORγt乙酰化下调。3.qPCR结果显示JQ1处理组相对于DMSO溶剂对照组Th17细胞相关细胞因子IL-17A、IL-17F表达等降低。4.ELISA结果显示相对于DMSO溶剂对照组,JQ1处理组抑制IL-17表达。5.HE染色和天狼星红染色显示经过JQ1处理后感染小鼠肝脏肉芽肿和纤维化减轻。6.小鼠肝脏肉芽肿细胞qPCR结果显示,相对于DMSO溶剂对照组JQ1处理组IL-17显著下调。流式细胞术检测小鼠的肝脏肉芽肿细胞,与DMSO溶剂对照组相比,JQ1处理组IL-17~+和RORγt~+T细胞的表达显著下调。7.JQ1是通过与BRD区域结合抑制p300的乙酰化转移酶活性。【结论】JQ1通过与p300的BRD结构域相结合,阻断p300乙酰化RORγt,抑制Th17细胞炎性效应,减轻日本血吸虫虫卵肝脏肉芽肿和纤维化病变。