奶牛乳腺炎不仅影响奶牛业的发展，也给乳品生产带来了巨大的损失。引起奶牛乳腺炎的病原菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌。由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎一方面主要采用抗生素治疗，但此治疗方法导致耐药菌株出现的越来越多，而且抗性奶对人类的健康也带来了一定的威胁。另一方面主要采用疫苗，但目前针对金黄色葡萄球菌活的或者灭活的菌体，分离的黏附素、毒素和多糖等毒力因子制作的疫苗对防治奶牛乳腺炎效果都不理想。因为疫苗的主要作用机理是激发机体产生抗体，随着分子生物学和免疫学技术的发展，研发针对金黄色葡萄球菌的新型抗体制剂受到了研究者的青睐。单链抗体(single-chain variable region fragment，scFv)是由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过柔性短肽连接构成，且保留了较完整的抗原结合位点。scFv作为基因工程抗体的一种有着不可比拟的优点：分子量小，穿透组织的能力强，不包含Fc片段，可以避免非特异性的结合。此外，已有越来越多的scFv药物应用到一些疾病的临床治疗中。基于此，本研究构建了针对金黄色葡萄球菌的牛源scFv并对其功能和保护作用进行研究，旨为奶牛乳腺炎抗体制剂的研发提供一定的依据。　　1牛源抗金黄色葡萄球菌 FnbpA和 ClfA单链抗体的构建　　设计扩增牛抗体VH和VL引物对于准确扩增牛源scFv编码基因至关重要！但目前关于牛源的scFv鲜有报道，本文通过分析数据库中有关牛抗体基因相关线索，筛选并设计了一对引物，从患金黄色葡萄球菌乳腺炎的奶牛外周血淋巴细胞中提取RNA作为模板扩增scFv的VH和VL，利用重叠延伸PCR将VH和VL通过linker-(Gly4Ser)3连接构建scFv；然后将scFv基因克隆入原核表达载体pOPE101-XP后转化E.coli XL1-Blue进行诱导表达并提取周质腔可溶性蛋白；最后通过间接ELISA的方法筛选针对金黄色葡萄球菌感染过程中重要的毒力因子纤连蛋白结合蛋白(FnbpA)和凝集因子(ClfA)的牛源scFv。最终我们获得了两株亲和力较高的阳性克隆scFvZW.28和scFvZW.132，Western blot分析表明两株scFv能够与FnbpA和ClfA特异性结合，且在体外LB培养基上能一定程度抑制金黄色葡萄球菌的生长。本章研究一方面验证确定了编码牛源scFv基因的有效引物，为后面牛源scFv噬菌体文库的构建提供了实验依据；另一方面也证明了研制牛源scFv用于抑制金黄色葡萄球菌是可行的，为后续牛源scFv的研制及功能研究提供了有力的支撑。　　2牛源单链抗体噬菌体表达文库的构建和抗金黄色葡萄球菌单链抗体的筛选　　通过前面验证确定的扩增编码牛源scFv基因的引物构建了牛源scFv噬菌体表达文库。首先从患金黄色葡萄球菌乳腺炎的奶牛外周血淋巴细胞中提取 RNA作为模板扩增VH和VL，采用重叠延伸PCR将VH和VL通过linker-(Gly4Ser)3连接构建 scFv基因并与噬菌粒载体 pCANTAB-5E连接，连接产物电转化 TG1感受态细胞，经过50次电转后得到了库容量为2×106cfu/mL的噬菌体文库，且文库的阳性率高，多样性良好。以金黄色葡萄球菌全菌裂解产物作为抗原对噬菌体文库经过四轮的反复淘选后，文库滴度为107cfu/mL，富集了81倍。从第四轮中随机挑取96个克隆制备噬菌体抗体，采用噬菌体ELISA的方法，筛选到了8株针对金黄色葡萄球菌全菌抗原的亲和力较高的scFv(OD450>0.6)，命名为scFvZW.1，ZW.2，ZW.12，ZW.22，ZW.33，ZW.68，ZW.73和ZW.88。这8株scFv的基因序列FR区比较保守，CDR区变异较大，尤其是VH的CDR3区。　　3针对金黄色葡萄球菌的牛源单链抗体的原核表达及其保护作用研究　　上一节中通过噬菌体展示技术筛选到了针对金黄色葡萄球菌全菌抗原的8个scFv，但由于噬菌粒载体pCANTAB-5E为E-tag标签载体，目前还没有较好的纯化E-tag的方法，所以本章中我们将8个scFv基因片段装入pET-28a(+)载体进行诱导表达并纯化。纯化的8个scFv和它们的混合物在LB培养基内与金黄色葡萄球菌共同孵育进行体外抑菌实验的研究，抑菌结果显示8个抗体体外能不同程度抑制金黄色葡萄球菌的生长，其中scFvZW.12，ZW.88，8个scFv混合物抑菌作用较好。在动物的保护试验中，针对不同抗原表位抗体的“鸡尾酒”组合能产生累加和协同效应，比单一抗体作用更强，所以我们采用8个scFv联合作用来研究其对金黄色葡萄球菌所致小鼠乳腺炎的保护作用。24只泌乳10-15d的昆明小鼠随机分为正常对照组(C)、阴性处理组(NC)、阳性处理组(PC)和scFv治疗组(scFv)。正常对照组和阴性处理组小鼠第四对乳腺攻入生理盐水，阳性处理组和scFv治疗组第四对乳腺分别攻入青霉素和8个scFv混合物。6h后，除正常对照组小鼠第四对乳腺各攻入50μL生理盐水外，其余三组攻入50μL108cfu/mL的金黄色葡萄球菌。结果显示，相对于生理盐水的阴性处理组，scFv治疗组乳腺组织细胞因子IFN-γ和IL-4的含量显著升高(P<0.05)，炎症因子TNF-α的含量显著降低(P<0.05)。同时病理切片显示，scFv治疗组乳腺结构相对完整，炎性细胞渗出较少。说明scFv对金黄色葡萄球菌所致小鼠乳腺炎有一定的保护作用。这些为防治奶牛乳腺炎的抗体制剂的研发奠定了基础。　　4牛源金黄色葡萄球菌单链抗体基因治疗小鼠乳腺炎的研究　　与完整的抗体相比，scFv分子量小，组织的穿透力强，免疫原性低，作为药物的靶向载体有很多优势，但是它半衰期短，在血浆中的清除速度快，作为药物的治疗制剂还存在着一定的缺陷；而真核DNA质粒在组织中不仅能表达目的蛋白，且可以存在两个月之久。所以本章将前面筛选到的针对金黄色葡萄球菌全菌抗原的scFvZW12和scFvZW88插入到真核载体pcDNA3.1中构建重组质粒，采用脂质体的方法将两个重组质粒转染COS-1细胞。Western blot分析结果表明，pcDNA3.1-scFv12和pcDNA3.1-scFv88不仅可以在细胞内表达，也能分泌到培养液上清中进行分泌型表达。将 pcDNA3.1-scFv12和 pcDNA3.1-scFv88的混合质粒经第四对乳腺导管注入到泌乳7d的小鼠的乳腺中，结果显示，scFvs蛋白3d的时候开始表达，7d时表达量开始上升。30只泌乳7d的昆明小鼠随机分为正常对照组(C)、阴性处理组(NC)、阳性处理组(PC)、scFv-Low治疗组(SL)和scFv-High治疗组(SH)。C和NC组小鼠经第四对乳腺导管攻入pcDNA3.1空白质粒100μg，SL和 SH组小鼠经第四对乳腺导管分别攻入 pcDNA3.1-scFv12和pcDNA3.1-scFv88的混合质粒100μg和200μg。7d后，PC组小鼠第四对乳腺攻入青霉素。6h后，除正常对照组小鼠第四对乳腺各攻入50μL生理盐水外，其余四组攻入50μL108cfu/mL的金黄色葡萄球菌。结果显示，相对于生理盐水的阴性处理组，SH治疗组乳腺组织炎症因子IL-1β的含量显著降低，TNF-α和IL-6有降低的趋势。病理切片显示，SH治疗组乳腺结构相对完整，炎性细胞渗出较少。说明scFv真核表达质粒能在一定程度上保护小鼠抵抗金黄色葡萄球菌的感染，这为奶牛乳腺炎的基因治疗提供了一定的理论依据。