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草地早熟禾(Poa pratenszs L.)属冷季型草坪草,是温带地区重要的草种之一。它具有色美、抗寒能力强、耐荫、耐修剪等优点,在我国北方地区多被用作建坪草种。草地早熟禾具有一些自身的缺点,如易受病虫危害、不耐炎热、耐高低温能力差、抗旱力不强等。这些不良性状在一定程度上都可以通过基因转化的手段得到改良。草地早熟禾遗传转化中常用的受体体系存在着植株再生困难、体细胞无性系变异发生频率高等缺点,严重制约了早熟禾基因工程育种研究的发展。因此,建立一种快速、高效而又不受基因型限制的转化受体系统对于早熟禾遗传转化有重要意义。 本研究以草地早熟禾(Poa pratensis L.)种子苗茎尖为外植体,建立了丛生芽再生体系。该体系是将草地早熟禾种子进行表面消毒,暗培养获得黄化小苗,切取茎尖(含胚轴和生长点)在附加2,4-D和6-BA的起始培养基上诱导形成基部膨大即分生细胞团和小愈伤(MCCSC),切下MCCSC转至附加6-BA的苗诱导培养基上形成丛生芽。研究表明不同激素浓度组合、MCCSC的诱导时间及光照等对丛生芽形成影响较大。茎尖在附加1-3mg/L 6-BA和0.2-1.0mg/L 2,4-D的起始培养基中培养20天,将MCCSC切下转至含1-3mg/L 6-BA的丛生芽形成培养基上,丛生芽诱导频率最高(大于70%),每丛芽数也最多(15.20个/丛)。 本工作对丛生芽发生途径进行了组织学研究,结果表明,在起始培养基中形成的基部膨大是由胚轴和生长点细胞增殖而形成的分生细胞团以及小愈伤组成的。当MCCSC转至苗诱导培养基中后,分生细胞团部位出现了芽原基和叶原基,继续培养,芽原基部位发育形成了浓密的芽丛。 本研究以三个草地早熟禾栽培品种奖品(Award)、午夜(Midnight)、新哥来得(NuGlade)的丛生芽芽尖为受体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,获得了转基因植株。该体系先培养早熟禾丛生芽8-10天,再将早熟禾丛生芽切至暴露出芽尖生长点,与农杆菌菌液浸染,同时在0.5×10~5Pa负压下处理5min,无菌滤纸略吸小芽块上的残留菌液后,于苗诱导培养基上共培养3天,然后转移到加有100mg/L头孢霉素的抑菌培养基上培养8天,再转移到加有5-7mg/L绿磺隆的