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目的：中国山东、河南遗传性无虹膜两家系致病基因的定位及突变筛查；构建基因PAX6RNAi载体；探讨基因PAX6沉默对B3细胞的影响。方法：1、致病基因筛查定位。(1)、分别采集山东遗传性无虹膜合并先天性白内障家系、河南遗传性无虹膜家系的临床资料及血液标本,进行经典遗传学分析和细胞遗传学检查。(2)、提取家系成员的基因组DNA,采用定位克隆的策略,对山东家系进行全基因组微卫星标记的扫描,经多重PCR反应,Genescan分析基因型,数据文件在Linkage5.2软件上运算,连锁分析计算Lod Score,单倍体分析,精确定位。对河南家系则在已有研究结果上直接进行该区域定位排查,并进一步精细定位。(3)、从NCBI (National Center for biotechnology Information)等数据库中搜寻定位区域内的候选致病基因的基因序列,设计引物,PCR扩增测序,进行突变筛查。2、PAX6RNAi载体构建。(1)、选择4个PAX6基因RNA干扰靶序列,设计与之对应的shRNA序列,构建并验证shRNA重组质粒载体,构建过表达外源PAX6融合蛋白的293T细胞模型。用shRNA质粒载体进行外源靶序列筛选。(2)、构建shRNA慢病毒载体,用shRNA慢病毒载体进行内源目标序列筛选,与外源筛选结果共同确定有效的PAX6RNAi靶序列。3、应用有效的shRN/干扰慢病毒感染B3细胞,观察PAX6基因干扰后对B3细胞的影响。结果：1、致病基因筛查定位。(1)、根据经典遗传学分析,两家系为常染色体显性遗传,细胞遗传学检查未发现染色体异常。(2)、定位克隆把山东家系致病基因定位于微卫星Markers D11S915和D11S4101之间,河南家系致病基因定位于微卫星Markers D11S1755和D11S935之间。(3)、对候选基因PAX6进行PCR双向测序,发现山东家系中PAX6基因的第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变,导致可能的mRNA拼接错误,而河南家系中未发现PAX6基因突变。2、PAX6RNAi载体构建。(1)、针对候选的4个PAX6干扰靶点,成功构建了PAX6shRNA的重组质粒载体及表达FLAG tag、PAX6、红色荧光蛋白的融合蛋白表达系统,并在293T细胞上构建了PAX6过表达模型。外源筛靶结果验证了1#、2#和4#靶序列是有效的干扰靶位点。(2)、成功构建了PAX6shRNA重组慢病毒载体,在表达内源PAX6的晶状体上皮细胞系B3中进行靶点筛选,其结果与外源筛选结果一致,1#、2#和4#shRNA重组慢病毒对PAX6基因均有明显的干扰效果。3、PAX6沉默的B3细胞,凋亡细胞数目异常增加。结论：1、山东家系的PAX6基因在第二个内含子的倒数第二个碱基腺嘌呤A发生缺失突变(IVS2-2delA),导致该家系出现先天性无虹膜及先天性白内障表型。2、河南无虹膜家系的致病基因位点定位在Markers D11S1755和D11S935之间。3、找到了3个PAX6RNAi的有效靶序列。4、建立了PAX6RNAi质粒载体及慢病毒载体。5、PAX6基因沉默引起B3细胞过度凋亡。