背景在肿瘤治疗领域,主动靶向药物递送系统早已引起各国的广泛关注。虽然该研究方向的论文发表量呈指数增加,却基本没有上市产品。基于物理化学和生物学原理分析,通过思考分子与纳米粒子在水介质中扩散能力的差异,以及纳米载体在体内的寻靶过程,已有很多研究工作剖析了主动靶向药物递送系统理论中存在的某些误区,揭示出主动靶向修饰的纳米载体有时并不能够按照载体设计初衷提高对肿瘤组织靶向效率的缺陷。EPR效应只适用于药物分子和具有足够扩散能力的纳米载体。目的为真正提高纳米载体对于肿瘤组织的靶向效率,提高成药性,我们将目光聚焦于依靠环境特异性响应的靶向释药纳米载体(以热敏感脂质体为模型)和具有强扩散能力的主动靶向纳米载体(以低密度脂蛋白为模型),这两种最具有可行性的靶向策略。本研究中旨在研究制备长春新碱及阿霉素共载药热敏脂质体(VD-TSL)和长春新碱人工低密度脂蛋白(VCR-a LDL),并进行一系列的物理化学性质评价,体外细胞评价,以及体内活体成像、药效学研究,说明这两种靶向策略可以显著提高纳米载体的肿瘤组织靶向效率。内容与方法第一部分:首先建立VCR与DOX同步分析的含量测定液相色谱检测方法,并进行了一系列方法学验证,接着采用薄膜分散法制备空白脂质体,p H梯度主动载药法实现VCR和DOX的同步载药,制备得到VD-TSL。以形态学研究、粒径和zeta电位、外观、热敏特性、包封率、磷脂分析、稳定性等为主要评价指标,进行评价。通过MTT法测定各组制剂结合加热对于两个细胞系的毒性,并利用激光共聚焦显微镜观察细胞摄取情况。建立裸鼠异种移植肿瘤模型,结合体外肿瘤部位局部加热,对VD-TSL进行了活体成像体内靶向分布研究,并对药效学及毒性进行了初步评价。第二部分:首先研究处方工艺,利用薄膜分散一步载药法,制备100nm和35nm的VCR-a LDL,随之进行粒径、zeta电位、包封率、形态学研究及稳定性等一系列物理化学性质评价。为比较两种粒径VCR-a LDL的扩散能力,我们进行了MTT单层细胞毒性研究、MTT扩散倒置细胞毒性研究、激光共聚焦观察肿瘤饼和肿瘤球模型载体渗透作用实验。接着建立了裸鼠异种移植肿瘤模型,进行VCR-a LDL的3D活体成像实验、组织分布研究及药效学评价。结果第一部分:制备得到平均粒径在85nm左右的VD-TSL,zeta电位约为零;透射电镜下观察,外观圆整;包封率达95%以上;制备多批样品,处方工艺重现性好;-20℃条件下放置6个月,VD-TSL稳定性良好。体外细胞毒性评价和摄取实验均表明VCR与DOX具有协同作用,同时加热还可以促进热敏脂质体进入肿瘤细胞内部,即包载药物的热敏脂质体与加热也有协同增效的作用。裸鼠异种移植模型活体成像实验也证明了以上结论。药效学实验结果表明,VDTSL结合肿瘤组织局部加热,具有很好的肿瘤抑制能力,抑瘤率达到了70%以上。同时,VD-TSL组裸鼠活动能力优于注射液组,且体重下降幅度最小,即显著降低了裸鼠的全身毒性。第二部分:制备了两个不同粒径的具有脂溶性核心和亲水性外壳结构的长春新碱人工低密度脂蛋白(VCR-a LDL),其中间粒径分别为100nm左右和35nm左右,呈正态分布,zeta电位基本为零。透射电镜下观察,可见VCR-a LDL的粒径大小分布均匀,外观圆整,并具有明显的壳核结构。不论100nm还是35nm VCR-a LDL,药物包封率均能够达到95%以上,且稳定性良好。细胞毒性MTT实验中两种粒径VCR-a LDL的细胞抑制率并无显著性差异,但MTT扩散倒置细胞毒性研究中,35nm VCR-a LDL扩散能力明显强于100nm VCR-a LDL,细胞抑制率更强。激光共聚焦显微镜下观察荧光标记的不同粒径a LDL对于体外肿瘤饼和肿瘤球模型的渗透作用,可见35nm a LDL的渗透能力虽没有荧光分子强,但显著强于100nm a LDL。3D活体成像实验中,与注射液组和100nm VCR-a LDL组相比,35nm VCR-a LDL组的肿瘤组织靶向滞留作用最强。药效学实验中,35nm VCR-a LDL组肿瘤抑制率最强,同时裸小鼠体重下降幅度最小,全身毒性最小。结论本研究成功研发制备了VD-TSL和VCR-a LDL,二者具有不同的靶向肿瘤释药原理,同时均具有良好的体外物理化学性质,及体内肿瘤组织靶向作用。工艺稳定重现性好。VD-TSL中结合了VCR与DOX的协同作用,以及载药热敏脂质体与加热效应的协同作用,是具有双重协同作用的环境控制靶向载体。VCR-a LDL中,a LDL本身自带主动靶向肿瘤的功能,通过考察100nm和35nm a LDL的靶向作用差异,说明减小粒径可以提高其扩散能力,能够充分利用EPR效应实现肿瘤组织被动靶向作用,才有基础进一步发挥主动靶向作用。