近年来,肿瘤免疫治疗逐渐成为非常重要的肿瘤治疗策略,众多新型肿瘤免疫治疗药物不断被研发出来,并在临床上取得了良好的治疗效果。但是纵观整个肿瘤免疫治疗领域,抗体类药物独占鳌头,已上市的药物中几乎没有除抗体外的其他类型。单克隆抗体虽然被广泛应用于临床,但其自身存在的弱点却一直制约着其发展和应用,甚至困扰了整个生物制药领域,比如免疫原性、生产工艺复杂、成本高等,极大地限制了抗体药物的应用。抗体存在的弱点促使人们将目光转向了小分子化合物,但是合成的小分子化合物也不可避免产生免疫原性等问题,并且还受到分子量等因素的限制。由此可见,肿瘤免疫治疗领域甚至延伸到肿瘤靶向治疗领域,现有的药物类型都非常单一,缺乏新的药物种类和药物来源。本论文提出了一种治疗性蛋白药物研发的新类型,将人源蛋白骨架作为新型治疗性药物,这样可以从根本上解决药物免疫原性问题,最大程度的降低临床使用过程中不良反应和副作用的发生。本论文首先利用计算机程序在PDB数据库中抓取了符合条件的人源蛋白并建立了人源蛋白骨架库,选择了肿瘤免疫治疗经典信号通路PD-1/PD-L1中的PD-L1作为靶点。通过将人源蛋白骨架作为新型PD-L1抑制剂进行筛选和生物活性评价进而探究人源蛋白骨架作为治疗性蛋白药物研发新类型的可行性和研发潜力。基于以上研究原理,本论文首先利用分子对接程序Patch Dock在构建的人源蛋白骨架库中筛选具有研发潜力的PD-L1抑制剂,通过设置的筛选条件,比如打分情况、与PD-L1结合构象、原始的细胞位置、原始功能、分子量大小等,最终选择了两个人源蛋白骨架作为示例进入生物活性评价。选择的蛋白骨架均来自细胞核,作为治疗药物与PD-L1结合时不会引起机体固有功能的紊乱,同时还不会产生免疫原性。蛋白骨架被构建在大肠杆菌表达载体上,加入用于表达和纯化的标签,成为重组蛋白,分别被标记为rhsRuvBL2和rU1 snRNPA。经过大肠杆菌表达和镍离子亲和层析纯化后,蛋白骨架rhsRuvBL2和rU1 snRNPA被成功表达纯化并通过SDS-PAGE和WB进行鉴定。定量后的蛋白骨架rhsRuvBL2和rU1 snRNPA被用于进行生物活性评价,来评估它们是否真正具有成为PD-L1抑制剂的能力。在生物活性评价中首先探究蛋白骨架rhsRuvBL2和rU1 snRNPA是否具有抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。本论文基于表面增强拉曼光谱建立了一种基于SERS检测蛋白相互作用的平台,实验结果表明rhsRuvBL2和rU1 snRNPA可以降低SERS信号强度,具有抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。为了进一步证明rhsRuvBL2和rU1 snRNPA是通过与PD-L1结合而抑制PD-1/PD-L1相互作用的,本论文选择了ELISA的方法进行检测。结果表明,rhsRuvBL2和rU1 snRNPA可以与PD-L1结合,EC50分别为135.3n M和55.17n M。同时rhsRuvBL2和r U1sn RNPA可以与PD-1竞争结合PD-L1,IC50分别为66.29n M和18.06n M。通过预激活CD4+T细胞与表达PD-L1细胞共培养实验评估rhsRuvBL2和r U1sn RNPA是否具有T细胞重激活能力,结果表明加入rhsRuvBL2或rU1 snRNPA的组中CD4+T细胞分泌的细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平明显增高,并且与浓度成正相关,说明rhsRuvBL2和rU1 snRNPA具有重激活T细胞的功能。体外抗肿瘤实验结果证明rhsRuvBL2和rU1 snRNPA具有依赖T细胞杀伤人黑色素瘤A375细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞的能力。在人免疫系统-黑色素瘤-免疫缺陷小鼠体内进行的实验结果显示,rhsRuvBL2和rU1 snRNPA具有体内抗黑色素瘤能力,并且不会对主要脏器造成损害。以上结果可以证明rhsRuvBL2和r U1sn RNPA具有作为PD-L1抑制剂的生物活性,可以用于进一步的研究和开发。此外,本论文还利用定点突变技术分别为rhsRuvBL2和rU1 snRNPA设计了3个突变体,用来进一步探究蛋白骨架rhsRuvBL2和rU1 snRNPA的作用机制,结果表明,rhsRuvBL2和rU1 snRNPA确实是依赖与PD-1竞争结合PD-L1的能力而发挥作用的,rU1 snRNPA的突变体A32D是值得进一步研究的候选蛋白骨架。综上,本论文以PD-1/PD-L1为研究模型成功将人源蛋白骨架作为一种新型PD-L1抑制剂,并取得了理想的生物活性。不仅筛选出的蛋白骨架rhsRuvBL2和rU1 snRNPA可以用于后续的研发,更主要的是证明了人源蛋白骨架作为治疗性蛋白药物的可行性,为肿瘤治疗领域提供了药物筛选和研发的新类型和新思路。