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木质纤维素是规模最大、分布范围最广、含量最丰富的一类可再生资源。微生物产生的纤维素酶降解纤维素产生的葡萄糖,可进一步被转化为乙醇等其它能源物质可以缓解目前的能源压力。嗜热毁丝霉能够产生热稳定性的纤维素酶,被称为潜在的高效中高温酶库。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质,是生物体内重要的第二信使。它能够降低真菌的碳代谢阻遏效应从而提高真菌产纤维素酶的能力,而腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶可共同调节细胞内的cAMP水平。本研究主要利用RNAi技术干扰嗜热毁丝霉的腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因的表达,及使用外源添加cAMP的方法,从多角度来研究cAMP及相关基因在嗜热毁丝霉基因表达调控中的作用。本论文的主要内容如下:1)干扰腺苷酸环化酶基因方面:腺苷酸环化酶是细胞响应外界环境信号、调节胞内cAMP水平的关键酶,同时也是能够催化ATP形成cAMP的唯一酶。本研究针对嗜热毁丝霉腺苷酸环化酶ac基因设计干扰序列,利用pUC19-MtPpdc-MtTpdc质粒构建重组干扰表达载体。将干扰表达载体和pAN7-1质粒共同转入嗜热毁丝霉中,成功获得干扰转化菌株AC1、AC2-1、AC2-3和AC2C。利用RT-qPCR技术筛选出干扰效果较好的AC1和AC2-3进行测酶活检测。经过滤纸酶活(FPA)、内切酶活(CMC)、纤维二糖水解酶(BG)测定后发现,在微晶纤维素诱导条件下培养第4 d时,与WT的酶活相比,转化子AC 1的FPA、BG、CMC酶活分别下降43%,24%,20%。而转化子AC 2-3的FPA、CMC、BG酶活与WT各酶活相比无明显下降。利用RT-qPCR技术检测AC1和WT的纤维素酶相关基因mRNA表达情况发现,AC1菌株的bgl2和egl1的表达量分别下降24%、53%。而其他纤维素酶基因bgl1,bgl3,egl3,及调控因子cre1,ace1,xyr1 mRNA的表达量没有降低。2)外源添加cAMP方面:本研究将嗜热毁丝霉接入含2mM cAMP的微晶纤维素培养基、玉米芯粉培养基、纤维二糖培养基中,以无添加cAMP的各个培养基中的嗜热毁丝霉为对照,测定FPA、BG、CMC酶活。发现在微晶纤维素培养基中,添加cAMP的菌液FPA酶活和CMC酶活都有所增加,分别在培养第7 d和第5 d时,比无添加cAMP菌液要高出1.76倍、1.75倍;BG酶活的变化不明显。而在纤维二糖培养基中,FPA酶活、BG酶活和CMC酶活变化均不明显。玉米芯粉培养基中,添加cAMP的菌液FPA酶活在第4d时,比无添加cAMP菌液要高出2.25倍,但是BG酶活和CMC酶活变化均不明显。RT-qPCR检测结果表明,外源添加cAMP微晶纤维素培养基中菌株的bgl1、bgl3、egl3、cre1 mRNA表达量分别增加3.97倍、3.35倍、2.97倍、1.27倍,而其他基因表达量变化不明显。iTRAQ结果分析,发现外源添加cAMP的菌株与无添加cAMP的菌株之间共有58个差异蛋白,这些蛋白与碳代谢、次级代谢、新陈代谢、淀粉和蔗糖代谢、戊糖磷酸通路、糖酵解、乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、氨基糖和核糖、半乳糖代谢、色氨酸代谢、抗生素生物合成等多个代谢通路相关。3)干扰磷酸二酯酶基因方面:磷酸二酯酶(phosphodiestera,PDE)特异催化第二信使cAMP和环磷酸鸟苷水解,与腺苷酸环化酶共同调节细胞内cAMP的水平。本研究针对嗜热毁丝霉磷酸二酯酶pde基因设计干扰序列,构建重组干扰表达载体。将干扰表达载体和pAN7-1质粒共同转入嗜热毁丝霉中,成功获得干扰转化菌株pde1-1、pde 1-2、pde 1-3、pde 3-1、pde 3-2和pde 3-5。经RT-qPCR检测pde 3-1干扰效果最好。研究发现微晶纤维素培养基中pde 3-1的FPA酶活、BG酶活、CMC酶活与野生型WT各酶活相比变化不明显。而在纤维二糖培养基中pde 3-1的FPA酶活、BG酶活、CMC酶活持续降低,在培养第4 d时,降低最多,分别是野生型WT各酶活的41%、40%和56%。RT-qPCR结果显示干扰菌株pde 3-1的bgl1,bgl2,bgl3和egl1四个纤维素酶基因mRNA表达量均明显下降,分别下降23%,75%,88%和66%。pde 3-1的碳代谢阻遏因子cre1 mRNA表达量是野生型的2.54倍。本研究结果表明,干扰ac基因,减少了从ATP合成形成的cAMP,从而部分抑制了嗜热毁丝霉纤维素酶基因的表达;提高胞外cAMP水平,能够增加嗜热毁丝霉某些纤维素酶基因的表达;而干扰pde基因的转化子中酶活变化不明显,检测其纤维素酶基因的正调控因子xyr1和负调控因子cre1,两调控因子的基因表达量均上调,它们对所调控的下游基因的影响需要综合多个因素,再表现为相应的蛋白活性,体现了胞内基因表达调控的复杂性。