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背景前列腺癌属于男性泌尿生殖系统比较常见的恶性肿瘤。在欧美男性中,前列腺癌占恶性肿瘤相关死因的第二位,为首发的癌症。据美国癌症协会统计,在2013年有238,590名男性患有前列腺癌,其中29,720会死于前列腺癌或是前列腺癌相关的疾病。前列腺癌在我国的发病率虽然尚无欧美国家的发病率高,然则却也在随着国人生活水平的提高而逐年升高,目前在男性泌尿生殖系统肿瘤中,其发病率已上升为的第3位。内分泌治疗是目前全球前列腺癌治疗的首选,但是临床上会观察到应用内分泌治疗一段时间后病人不可避免的会产生激素抵抗,或是有些病人在医治初始即对内分泌治疗耐药,研究者将此称为雄激素抵抗型前列腺癌。此类前列腺癌可以看做是前列腺癌发展的终末环节,可供选择的治疗方案相当有限,且病情进展较快,严重威胁病人的生命及降低生活质量。因此,此型前列腺癌不仅是前列腺癌治疗的难点也是治疗重点。如何寻找人雄激素抵抗型前列腺癌有效的治疗靶点及相应的诊疗方法,已经成为目前前列腺癌基础及临床研究的重要领域。越来越多的研究认为多聚磷酸肌醇-4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是新的抑癌基因,负向调控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信号通路。在人类前列腺癌中,雄激素受体(AR)在转录水平正向调节INPP4B,有研究认为激素抵抗型前列腺癌细胞可能不表达AR,且与正常组织相比,前列腺癌组织INPP4B的表达减少。这些使我们推测如果此类肿瘤细胞中重新表达INPP4B能够抑制肿瘤的生长。雄激素抵抗型前列腺癌常伴有10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)功能异常,最终致使同源重组修复缺陷。在此类肿瘤中应用聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)抑制剂能阻断DNA损伤修复的代偿通路,有效杀伤肿瘤细胞。同时有研究发现在多种肿瘤中存在PARP过表达,包括雄激素抵抗型前列腺癌,提示PARP抑制剂可能在此类前列腺癌中发挥治疗作用。然而也有报道称,PARP抑制剂能上调p-AKT水平,激活PI3K/AKT信号通路,从而影响疗效并产生耐药。综上,本研究试图观察转染INPP4B基因是否在抑制PC3细胞增殖的同时下调其p-AKT水平,与PARP抑制剂联合能否发挥协同抗肿瘤作用。目的研究转染INPP4B基因、PARP抑制剂处理应用对雄激素抵抗型前列腺癌细胞株PC3增殖的影响及两者联合应用能否对此类肿瘤细胞发挥协同抗肿瘤作用。方法体外培养PC3细胞及LNcap细胞,取对数生长期的细胞,逆转录PCR检测PC3细胞中INPP4B mRNA的表达情况(以LNcap为阳性对照)。PC3细胞转染INPP4B基因后实时定量PCR检测INPP4B mRNA的相对含量；Western blot检测PC3细胞由INPP4B蛋白的表达。实验设CON组、Lenti-INPP4B组、Lenti-GFP组、PARP抑制剂组、Lenti-INPP4B与PARP抑制剂联合组、Lenti-GFP与PARP抑制剂联合组,CCK-8法、Western blot、流式细胞术分别检测PC3细胞在各种处理后增殖、细胞中p-AKT表达水平、细胞凋亡及周期分布的改变。结果INPP4B mRNA在PC3细胞中呈阴性表达。转染携带INPP4B基因的重组慢病毒后,实时定量PCR显示Lenti-INPP4B组的INPP4BmRNA相对水平为(87.84±7.62); Western blot检测显示在INPP4B蛋白分子量处出现条带,显示INPP4B在PC3细胞中成功表达。转染病毒组：CCK-8法显示在转入病毒的第24h、36h、48h, Lenti-INPP4B组细胞活力分别为(66.18%4±2.32)%、(45.10±0.00)%、(29.35±3.19)%,与Lenti-GFP组细胞活力相比,差异有显著性意义(P<0.05)；流式细胞凋亡分析显示：Lenti-INPP4B组与Lenti-GFP组凋亡比例分别为5.48%、2.85%,差异无统计学意义(P>0.05)；Western blot显示Lenti-INPP4B组与Lenti-GFP组相比,p-AKT水平降低。PARP抑制剂组：CCK-8法显示0.1、1、10、20、40gM五个浓度的AG014699及DMSO作用48h,各组细胞平均活力分别为(93.58±3.51)%、(64.6±2.18)%、(57.15±3.38)%、(43.88±3.02)%、(40.60±0.86)%、(99.76±0.06)%,除0.1μM的AG014699外,剩下各浓度的PARP抑制剂对PC3细胞增殖的抑制作用与DMSO相比差异均有显著性意义(P<0.05)；10μM最接近且小于IC50,将10gM选为单药及转染INPP4B基因联合的合适浓度；AG014699(10μM)作用24、36、48h,各组PC3细胞平均活力分别为(88.53±1.73)%、(60.77±2.26)%、(54.12±1.96)%,与DMSO相比差异均有显著性意义(P<0.05);PI染色周期分布显示：1、10、201aM的AG014699作用48h后,G2/M期细胞比例分别为(23.50±2.90)%、(35.10±5.11)%、(55.97±3.75)%,显示随着药物浓度升高,G2/M期比例逐渐增加,高浓度的PARP抑制剂能将细胞阻滞在G2/M期；Annexin V-FITC/PI流式分析显示,1、10、20μM的AG014699作用于PC3细胞48h,凋亡率分别为6.54%、12.16%、23.53%,显示随着药物浓度增加,凋亡率逐渐增加；同时观察到细胞内p-AKT水平随着PARP抑制剂浓度的升高而§增加。转染INPP4B基因联合PARP抑制剂：首先倒置显微镜下观察到联合组与单独处理组相比,细胞数目明显减少、细胞皱缩且形态不规则；CCK8法检测显示细胞活力在24、36、48h分别为(49.85±0.30)%、(26.30±1.81)%、(9.72±3.10)%,与Lenti-INPP4B组、PARP抑制剂组单独作用相比,对PC3细胞增殖抑制有统计学意义(P<0.05)；PI染色周期分布显示,联合组细胞阻滞在G1期；Annexin V-FITC/PI流式检测显示PARP抑制剂组、Lenti-INPP4B与PARP抑制剂联合组凋亡比例分别为12.16%、17.71%,两者间差异无统计学差异(P>0.05)；相对于PARP抑制剂组,联合组细胞内p-AKT水平明显降低。结论1.人雄激素抵抗性前列腺癌细胞株PC3不表达INPP4B。2.转染INPP4B基因能够对PC3细胞发挥抗肿瘤作用。3. PARP抑制剂单独作用于PC3细胞能够发挥抗肿瘤作用。4.转染INPP4B基因联合PARP抑制剂在PC3细胞能够发挥协同抗肿瘤功能,有希望成为激素抵抗型前列腺癌联合生物治疗的靶点。