年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)为全球致盲眼病的主要原因。在我国约有250万人因白内障致盲,占全球白内障致盲总数的10%。随着人口的老龄化,预计我国每年新增白内障患者将超过100万,而我国的白内障年手术量尚不足以解决每年的新增例数。因此,我国的白内障盲防治问题十分严峻。而先天性白内障是指出生前即存在,或出生后才逐渐形成的先天遗传或发育障碍的白内障,超过1/3的患者是遗传所致。任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。因此,明确先天性白内障的发病机制对于治疗及预防先天性白内障的发生发展具有重要的意义。白内障摘除联合人工晶状体(intraocular lens, IOL)植入是目前治疗白内障最常用且效果较为理想的方法,而后囊膜混浊(posterior capsular opacification, PCO)是影响病人术后远期视力预后的最常见的并发症,其术后5年的发生率高达30%左右。虽然可以利用激光或者手术切开混浊的后囊膜,但是却增加了病人的经济负担,并会带来新的并发症。所以如何预防PCO的发生是眼科医生和病人都比较关注的一个问题。体细胞诱导成为多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。多能干细胞能够自我更新,能在体内外分化成几乎所有类型的细胞,在再生医学等方面有巨大的应用潜力,具有极高的理论研究价值。通常用来源于囊胚期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞、通过核移植得到的胚胎干细胞以及在成体细胞中转入外源转录因子得到的iPSCs,进行体细胞重编程研究。在短短数年的时间里,此项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展；而且这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。与胚胎干细胞研究相比,体细胞重编程技术可以为更多的患者提供特异性多能干细胞。因而,在医学应用方面(例如器官培养和器官移植等)有广阔的前景。患者特异性的多能干细胞的建立能够为疾病发病机制的研究、治疗药物的筛选及细胞移植治疗提供有力的工具。采用慢病毒载体将外源性转录因子导入白内障患者晶体上皮细胞,从而获得诱导性多能干细胞。白内障患者来源的多能干细胞的建立,能够为晶体发育、细胞分化、衰老提供便利的细胞模型,同时可为白内障治疗药物的筛选及白内障发病机制的研究提供有力的研究工具。第一部分原代人晶体上皮细胞的体外培养目的对正常人晶体、年龄相关性白内障晶体上皮细胞及人皮肤成纤维细胞进行体外培养,并观察体外培养的晶体上皮细胞及皮肤成纤维细胞的生物学特性及组织学变化。方法正常人晶体上皮细胞培养取材于角膜移植术后供体眼的晶状体囊膜,年龄相关性白内障晶体上皮细胞培养取材于白内障超乳手术中撕除的晶体前囊膜。角膜移植术后供体眼的晶状体沿赤道部后方约2mm环形剪开后囊膜,小心取下完整的前囊膜和赤道部囊膜,剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法,进行原代人晶状体上皮细胞的培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成1mm×1mm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成1mm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经多次传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。在倒置相差显微镜下对三种细胞进行形态学观察。采用CCK-8法连续7天测定三种细胞的增殖速率,绘制生长曲线并进行比较。结果正常人晶体囊膜组织块贴壁48～72小时后可见人晶状体上皮细胞从组织块边缘长出,约10～15天达到融合。初期正常人晶体上皮细胞为多角形,胞体透亮,细胞边界清晰。融合后的细胞具有上皮细胞的形态特征,为典型的六角形或多边形。在体外细胞可传五代,但第三代以后细胞表型向成纤维细胞转化。第三代以后正常人晶体上皮细胞胞体呈梭形或长条形。第五代正常人晶体上皮细胞老化,胞浆内出现大小不等的空泡样改变,最后崩解死亡。白内障患者晶体上皮细胞形态与增殖能力与正常晶体上皮细胞相类似,但部分白内障晶体上皮细胞与正常人晶体上皮细胞形态差异较大,更接近成纤维细胞,且细胞在第一次传代后即老化崩解。人皮肤成纤维细胞伸展呈梭形或多边形,在经过多次培养传代后,可得到较为纯化的成纤维细胞。CCK-8法绘制的生长曲线表明人皮肤成纤维细胞具有最高的增殖速率,白内障患者的晶体上皮细胞增殖最慢。结论利用组织块贴片法进行人晶状体上皮细胞培养,操作简单,成功率高。第二代人晶状体上皮细胞是进行细胞学及相关研究比较理想的实验对象。正常人晶体上皮细胞具有较好的生长及增殖能力,而白内障晶体上皮细胞增殖力差、细胞形态不佳。人皮肤成纤维细胞在消化离心后经过多次传代能够获得纯化的成纤维细胞。人皮肤成纤维细胞增殖最快,正常人晶体上皮细胞增殖速率居中,白内障患者晶体上皮细胞增殖速率最慢。第二部分白内障患者诱导性多能干细胞的建立目的分别构建表达OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体(Lentivirus),并转染年龄相关性白内障患者体外培养的晶体上皮细胞,诱导建立患者来源的诱导性多能干细胞,与同一患者来源的皮肤成纤维细胞对比,观察限定因子对于诱导多能干细胞的诱导效率。方法选择3例诊断为年龄相关性白内障的患者,取其晶体前囊膜及皮肤组织进行体外培养。白内障晶体前囊膜在超乳手术中完整取材、洗去粘弹剂之后剪成lmm×lmm大小的组织块,利用组织块贴片法进行培养。使用0.25%胰酶溶液对融合后的细胞进行消化传代。取上述3例年龄相关性白内障患者的皮肤组织,剪成Imm3大小的组织块,过夜消化,离心收集细胞,经传代后,获得较为纯化的皮肤成纤维细胞进行培养。分别将含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒载体质粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同辅助质粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T细胞,重组包装构建慢病毒载体(分别为Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4).将构建的三种慢病毒载体混合分别感染第2代的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,培养5天后,与小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)进行共培养,直至出现iPSCs。采用碱性磷酸酶(ilkaline phosphatase, AKP)染色比较白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异。同时培养人H9胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)进行对照。结果利用组织块贴片法培养的白内障患者晶体上皮细胞及消化法培养的人皮肤成纤维细胞形态与增殖能力较好,第2代细胞适用于进行慢病毒感染。构建的慢病毒载体enti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染两种细胞,并不影响细胞的状态及增殖能力。在慢病毒载体转染后第5天,将白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞分别与MEFs进行共培养,在转染后第12天开始出现与ESCs形态相似的细胞克隆。细胞克隆碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)染色阳性,说明已成功诱导出iPSCs。采用AKP染色各比较3例患者的白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞诱导生成iPSCs的效率差异,在1×106的细胞接种密度下,白内障晶体上皮细胞平均可生成27.7个AKP阳性的细胞克隆,而人皮肤成纤维细胞平均仅生成15个细胞克隆。白内障晶体上皮细胞诱导形成的iPSCs细胞克隆与ESCs在细胞形态上具有相似性。结论构建的慢病毒载体Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4能高效转染白内障晶体上皮细胞和人皮肤成纤维细胞,并成功诱导出与ESCs形态相似、AKP染色阳性的iPSCs,且白内障晶体上皮细胞与人皮肤成纤维细胞相比具有更高的iPSCs诱导效率。第三部分白内障患者诱导性多能干细胞的鉴定目的对诱导建立的白内障患者来源的诱导性多能干细胞(iPSCs)进行鉴定,检测细胞的分子标记及体内外分化能力,评价其多能性。方法对已成功诱导的白内障患者来源的iPSCs进行多能性鉴定：基因表达、免疫荧光染色分析、RT-PCR检测、体外分化拟胚体、体内分化畸胎瘤检测。提取iPSCs、ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA采用HG-U133-2array (Affymetrix)对三种细胞的全基因表达谱进行检测并进行对比。提取iPSCs、 ESCs和白内障患者晶体上皮细胞的总RNA, RT-PCR检测人ESCs标志性基因(Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2、VIMENTIN)表达。采用细胞免疫组化荧光(immunohistochemistry, ICH)检测人ESCs标志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、 TRA-60、TRA-81、OCT-4)的表达。将iPSCs悬浮培养观察拟胚体(embryoid body,EB)形成,并在培养基中添加特殊成分(BMP4, FBS, retinoic acid (RA))观察EB的体外分化。将iPSCs接种至裸鼠皮下,观察畸胎瘤形成及体内分化情况。结果基因表达谱的分析结果显示,iPSCs与ESCs(?)(?)基因表达谱极为相似,但与白内障患者晶体上皮细胞的基因表达谱有较大差异。我们选择了1例56岁的年龄相关性白内障患者的iPSCs,并随机选择其中4个细胞克隆(分别命名为iPS1、iPS2、iPS3、iPS4)进行检测。RT-PCR检测的结果显示,iPS1与ESCs的ESCs标志性基因Nanog、OCT-4、REX-1、SOX-2和VIMENTIN的表达最为相似,而其他3株克隆与ESCs存在一定的差异。对iPS1进行ICH检测显示,人ESCs标志性抗原(SSEA-3、SSEA-4、Nanog、TRA-60、TRA-81、OCT-4)在iPS1中明显表达。体外分化拟胚体的结果显示,EB的分化使得Nanog和OCT-4表达下调,培养基中分别添加BMP4、FBS、RA之后,外胚层标志性基因NACM、TH和GFAP/内胚层标志性基因amylase、SOX7和AFP/中胚层标志性基因PECAM、desmin和SCL在EB中的表达均出现了不同程度的上调表达。对EB细胞进行ICH检测结果显示,EB细胞表达中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、外胚层标志物β-微管蛋白(tubulin beta1, Tuj-1)和内胚层标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)。体内分化畸胎瘤的结果显示,裸鼠注射iPSCsl个月左右可在裸鼠注射部位见肿块形成,2个月后摘除肿瘤进行组织切片检查,镜下可见三个胚层的组织细胞。结论研究诱导的iPSCs在基因表达谱、ICH、RT-PCR检测、体内外分化能力方面与ESCs极为相似,建立的iPSCs具有与ESCs相同的多向分化能力。第四部分白内障患者诱导性多能干细胞向晶体前体细胞的分化诱导目的探讨利用诱导因子三步法将白内障患者来源的多能干细胞诱导为晶体前体细胞的方法,评价分化细胞与晶体细胞的相似性。方法对已成功诱导的白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs及ESCs进行三步法的分化诱导：在细胞培养基中添加(1)第0～5天100ng/ml Noggin;(2)第5～15天100ng/ml bFGF、20ng/ml BMP4和20ng/ml BMP7;(3)第15～30天100ng/ml FGF2和20ng/ml Wnt-3a.每5天提取iPSCs和ESCs的RNA, RT-PCR检测晶体细胞分化标志基因PAX6、SCX2、SIX3、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP表达情况,并绘制变化曲线。采用ICH检测分化过程中晶体细胞分化标志PAX6、α晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达。提取iPSCs、ESCs和人晶体的总蛋白,Western-blot法检测晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达水平并进行比较。取3例人晶状体,分别为22岁、44岁和65岁,提取总蛋白,并提取白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs、人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs的总蛋白,Western-blot法检测间隙连接蛋白43(connexin43)和纤维连接蛋白(fibronectin),以评价其上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)的程度。结果经过三阶段诱导因子的作用后,对发生分化的iPSCs和ESCs进行的RT-PCR检测显示,PAX6、CRYAB、CRYAA、BFSP1和MIP的表达持续上升,SOX2的表达持续下降,SIX3的表达则是先上升后下降。ICH检测的结果显示分化过程中,iPSCs出现了晶体细胞分化标志PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的持续表达。Western-blot的结果显示,iPSCs、ESCs和人晶体中均有PAX6、α-晶体蛋白和β-晶体蛋白的表达,但ESCs的蛋白表达水平相对较低。EMT评价的结果显示,connexin43在22岁晶体中表达量最高,随着年龄的增加而明显降低,fibronectin则随着年龄的增加表达量逐渐增高；而在白内障患者晶体上皮细胞来源、人皮肤成纤维细胞的iPSCs及ESCs诱导分化的细胞中,connexin43在白内障患者来源的细胞中表达量最高,而fibronectin(?)勺表达相似。结论三阶段诱导因子的组合作用能够成功诱导出晶体前体细胞,且诱导分化的细胞能够稳定表达晶体细胞的标志性基因及蛋白。白内障患者晶体上皮细胞来源的iPSCs(?)比人皮肤成纤维细胞来源的iPSCs及ESCs具有更低的EMT程度。