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伪结核病是由伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）引起的一种慢性人畜共患传染病。该病的流行十分广泛,在动物临床上,主要以山羊和绵羊发病最为常见。伪结核棒状杆菌为胞内寄生菌,主要通过伤口感染,可被巨噬细胞和中性粒细胞吞噬,并保持活性,随血液和淋巴传播至其他地方,在感染部位形成脓肿,并导致宿主细胞死亡。由于伪结核棒状杆菌感染形成的病灶表面包有一层厚而致密的包囊,诸多药物难以通过包囊而渗入其内,不能彻底杀死脓肿内的病原菌,因此对该病的防控十分困难,需进一步阐明该病原致病的机制。伪结核棒状杆菌致病作用与其引发的脓肿具有密切关系,其特征是受感染部位炎性细胞因子显著增加,然而其致炎机制并不完全清楚。磷脂酶D（pld）由pld基因编码,是伪结核棒状杆菌最主要的毒力因子,也被认为是一种具有白细胞毒性的外蛋白,在感染过程中有助于伪结核棒状杆菌侵袭局部淋巴结,与巨噬细胞的破坏及引起其他组织器官的病变密切相关。本文构建了伪结核棒状杆菌的pld基因缺失株,并对其包括致炎作用等生物特性进行评价,为进一步研究pld在该病原感染致病的作用机制提供科学基础。1.伪结核棒状杆菌ATCC 19410及XH02菌株pld缺失株的构建本研究利用经典的同源重组技术,以ATCC 19410及XH02为目标菌,尝试用三种方案构建伪结核棒状杆菌的pld基因缺失株,分别为方案一:用pMD19-T载体连接同源臂后用双交换方法构建缺失株;方案二:用ZTOPO-T载体利用单交换方法构建缺失株;方案三:用pK18mobsacB为基因敲除载体利用双交换方法构建缺失株。其中,前两种方案均在电转化之后未长出单个菌落,只有使用方案三构建成功。其方法如下:扩增获得pld基因上游同源臂（1326 bp）和下游同源臂（970bp）,以融合PCR将上、下游同源臂连接,克隆进ZTOPO-T载体,测序验证后,通过双酶切将上下游同源臂融合片段连接到质粒pk18mobsacB,构建出含pld基因的自杀重组质粒pk18mobsacB/Δpld。将pk18mobsacB/Δpld电转入伪结核棒状杆菌感受态细胞,以含卡那霉素的鲜血琼脂平板筛选出第一次同源重组的卡那霉素抗性克隆。将第一次同源重组的伪结核棒状杆菌涂布于含20%蔗糖的血琼脂LB平板上,通过蔗糖致死基因（sacB）负筛选出经过第二次同源重组的克隆。经PCR鉴定和产物测序,证实获得了无痕缺失pld基因（在pld内部缺失了496 bp）的伪结核棒状杆菌菌株。协同溶血试验发现,伪结核棒状杆菌野生株与马红球菌（ATCC6939）显示出显著的协同溶血活性,而pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld及XH02Δpld）则完全失去了与马红球菌的协同溶血作用。说明ATCC 19410及XH02菌株的pld缺失株均构建成功。将ATCC 19410Δpld及XH02Δpld分别连续传代培养,在9代内均无回复野生型现象。2.伪结核棒状杆菌pld基因缺失株与野生株体外生物学特性比较将ATCC 19410野生株和pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld）在鲜血琼脂培养基上培养,以观察其菌落形态和染色特点;然后在含不同浓度NaCl（正常渗透压和10%NaCl）、不同pH条件（pH 5.0和pH 9.0）下培养,测定ATCC 19410野生株和pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld）的生长曲线,观察缺失pld基因对伪结核棒状杆菌环境适应性的影响;进一步将pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld）和ATCC19410野生株体外侵染J774A.1巨噬细胞,裂解稀释涂板计数,评价pld基因缺失对伪结核棒状杆菌细胞粘附性的影响。结果发现,pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld）和ATCC 19410野生株的菌落形态、染色特性及对不同渗透压和pH的适应性均无显著差异。在细胞黏附方面,与ATCC 19410野生株相比,ATCC 19410Δpld对J774A.1巨噬细胞的粘附能力下降26.63%。表明,pld基因缺失对伪结核棒状杆菌的生长繁殖和对巨噬细胞的黏附作用无显著性影响。3.伪结核棒状杆菌pld基因缺失株与野生株体内致病性比较将ATCC 19410野生株和pld基因缺失株（ATCC 19410Δpld）体内接种SPF昆明系小鼠（6×105 CFU/0.2 mL/只）,连续2周观察小鼠发病死亡情况,绘制小鼠的生存曲线。进一步将ATCC 19410和ATCC 19410Δpld体内接种C57BL/6小鼠（1×105 CFU/0.2 mL/只）,检测小鼠肝脏和脾脏组织的载菌量,评价pld基因缺失对小鼠致病力的影响。结果显示,与ATCC 19410野生株引起85.7%SPF昆明系小鼠死亡相比,ATCC 19410Δpld的致病力降低71.4%,且所感染小鼠死亡时间延后。ATCC 19410Δpld感染C57BL/6小鼠肝脏和脾脏中的伪结核棒状杆菌载菌量均低于野生型菌株,其中以脾脏最显著,其载菌量下降84%。表明,pld基因缺失可显著降低伪结核棒状杆菌对小鼠的致病力。将ATCC 19410Δpld和ATCC 19410野生株体内接种小鼠（6×105 CFU/0.2 mL/只）,12 h后取腹水、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏检测细胞因子IL-1β和TNFα。结果发现,整体上,与野生型菌株ATCC 19410感染小鼠相比,ATCC 19410Δpld感染小鼠腹水、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中IL-1β和TNFα含量均下降,其中ATCC19410Δpld感染小鼠肺脏和腹水中的TNFα含量显著低于ATCC 19410野生型菌株,而ATCC 19410Δpld基因缺失株感染小鼠肝脏和肾脏中IL-1β含量显著低于ATCC19410野生型菌株。表明pld基因缺失可减轻伪结核棒状杆菌感染小鼠的致炎作用。综上所述,本研究成功构建了伪结核棒状杆菌标准株ATCC 19410和临床分离株XH02的pld基因缺失株ATCC 19410Δpld和XH02Δpld,pld基因缺失对伪结核棒状杆菌的培养特性、环境适应性及对巨噬细胞的黏附能力无显著性影响,但可以显著降低该病原感染的致炎作用和致病力,为进一步阐明伪结核棒状杆菌的pld基因的致病机理奠定了基础。