生物固氮是一些原核生物利用体内的固氮酶,在常温常压下将空气中的N2转变成NH3的过程。其中,钼铁固氮酶是研究固氮酶催化机制的模式蛋白。已知N2和H+还原的过程发生在MoFe蛋白的活性中心(FeMoco)上,而P-cluster负责为其提供电子。本室前期通过检测不同来源的固氮酶动力学特征,发现每还原1摩尔N2,伴随的产H2量总是大于1摩尔,推测MoFe蛋白至少含有2条电子传递通路。前期证明了一条从P-cluster到活性中心S2B的电子传递通路,本研究采用理论计算与分子生物学及生物物理学等技术相结合的策略,探讨从P-cluster到活性中心之间其他可能的电子传递通路。根据固氮酶局部多肽微环境,利用SPDBV4.01软件逐个寻找(?)ebsiella oxytoca钼铁蛋白(PDBID:1QGU)从P-cluster到FeMoco之间可能参与电子传递的氨基酸,预测了一条可能的电子传递通路,即：P-cluster→β-93Cys→β-102Asfl→β-107Glu→α-431Lys→α-423II→高柠檬酸(长臂O4)→FeMoco (Mo位),推测β-102Asn,α-431Lys和α-423Ⅱe可能是其中重要的位点。利用定点突变和基因重组技术,成功地将产酸克氏杆菌(K. oxytoca M5al)固氮酶的β-102Asn,α-431Lys和α-423Ilee分别替换为Ala, His和Pro,获得单一位点突变菌株Nβ102A, Ka431H和Ia423P。经厌氧摇瓶培养,发现Ia423P菌株在固氮条件下几乎不能生长且细胞水平的固氮酶活性显著下降,而RT-qPCR结果显示,编码MoFe蛋白α亚基nifD基因的转录水平是野生菌株的4倍,说明固氮酶自身活性下降是导致细胞不能在固氮条件下生长的原因。提纯固氮酶并检测其特征,发现：(1)Iα423P突变固氮酶的最高乙炔还原和最高质子还原活性仅为野生型固氮酶的13%和21%,表明α423Ile的突变对固氮酶催化活性的影响很大；(2)静态电子顺磁光谱(EPR)显示,突变固氮酶的FeMoco含量降低,说明α-423Ile在结构上对固氮酶至关重要。通过构建3组不同的双位点突变菌株及表型分析,发现α-423Ile→ro与高柠檬酸→柠檬酸的突变效果并不完全相同,二者同时突变后细胞的固氮酶活性均低于单一位点突变株,说明二者在固氮酶结构中至关重要。推测α423Ile很可能是电子进入FeMoco的另一个入口氨基酸。基于最新公布的Azotobacter vinelandii钼铁蛋白完整的晶体结构(PDB ID:3U7Q),通过VMD-Pathways软件从理论上直接计算共找到3条可能存在的电子传递通路,并利用软件模拟不同氨基酸替换α-191Gln和α-65Ala后电子传递通路的变化。同时,利用实验室现有的7个a-191Gln单位点突变株,经发酵培养和蛋白提纯获得了相应的固氮酶,检测发现它们的催化还原能力均有不同程度的下降,而停滞光谱(Stojped-flow spectra)检测结果显示Q191P-和Q191S-MoFe蛋白中电子传递速率减慢,证实α-191Gln在固氮酶电子传递中发挥重要作用。本研究结果证明,α-423Ile和α-191Gln均在固氮酶电子传递过程中发挥重要作用。其中,·α-191Gln位于从P-cluster至FeMoco的S2B这条电子传递通路中,推测该通路为N2的还原提供电子同时伴随放氢反应；而αα-423Il3可能是电子从另一条途径,即：由P-cluster经高柠檬酸长臂进入活性中心钼位的入口氨基酸,为Mo位提供电子用于H+的还原。本研究为固氮酶的“双位点放氢模型”提供了实验证据,为进一步探讨固氮酶的催化反应机制奠定了基础。