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单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是重要的人兽共患食源性病原菌，对人和多种动物的健康威胁较大。LM能在多种毒力因子作用下，穿越宿主的肠道屏障、血胎屏障和血脑屏障，从而引起败血症、脑膜炎、流产等疾病，死亡率高达30%。LPXTG基序表面蛋白在 LM感染细胞过程中发挥重要作用。Lmo0331蛋白是根据LM全基因组序列推测的LPXTG基序表面蛋白，但是其功能尚不清楚。本研究以绵羊李斯特菌病的脑组织分离株 LM90SB2（血清型 4b）为研究对象，首先对 LM90SB2的lmo0331基因进行序列分析及原核表达；利用同源重组技术构建LM90SB2的lmo0331基因缺失株，与亲本株比较，对不同细胞粘附侵袭能力、小鼠的致病性、环境适应性等生物学特性，初步探究lmo0331基因的功能。为进一步研究LM的致病机制奠定基础。 1.LM90SB2 lmo0331基因分析和原核表达 为了对单增李斯特菌临床分离株LM90SB2的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、蛋白质结构域分析和原核表达。根据GenBank中收录的lmo0331基因序列设计特异性引物，利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因，将扩增产物克隆到pMD19-T载体，测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析；构建表达质粒pET32a-0331，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示，LM90SB2 lmo0331基因核酸序列与NTSN株(4b型，绵羊脑，中国江苏)、F2365株（4b型，奶酪，美国）、LL195株（4b型，瑞士）及WSLC 1033株的同源性为100.0%，与N2306株(4b，李斯特菌病人的血液，瑞士)、02-1792株（4b，加拿大，奶酪）、H34株的同源性为99.9%。分离株LM90SB2的lmo0331基因全长1956 bp，ORF全长为1857 bp，共编码618个氨基酸；蛋白结构域预测结果显示，Lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88ku重组蛋白带，Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。 2.LM90SB2△lmo0331缺失株的构建 为了构建LM90SB2△lmo0331缺失株，PCR扩增LM90SB2 lmo0331基因的上下游臂，通过重叠PCR技术将lmo0331基因的上下游臂融合扩增得到△lmo0331基因片段，将△lmo0331基因片段与自杀性质粒pKSV7连接。将重组质粒pKSV7-△lmo0331电转化到LM90SB2感受态中，PCR筛选阳性转化子。获得的阳性转化子置于含氯霉素的BHI培养基中41℃传代培养，在双重压力下实现同源重组，旁侧引物检测重组情况。重组完全的菌株置于30℃无抗性培养基中连续传代，丢失pKSV7穿梭质粒，并检测其稳定性。通过PCR 和测序结果显示表明 lmo0331 基因编码区被完全删除，且缺失株具有良好的遗传稳定性。 3. lmo0331基因缺失对LM90SB2体外环境耐受性影响 为了探究lmo0331基因对LM环境适应性的影响，比较了LM90SB2△lmo0331和LM90SB2在不同温度、pH、渗透压下生长特性、生物被膜形成能力等差异。结果显示：在 4℃环境下， LM90SB△lmo0331 缺失株的生长速度显著高于 LM90SB2 野毒株(P<0.05)；体外耐酸耐碱试验中，在碱性环境中（pH=9）LM90SB2△lmo0331缺失株生长能力低于亲本株 LM90SB2(P<0.05)；在含 4.5%乙醇的 BHI 培养基中， LM90SB2△lmo0331生长趋势显著低于LM90SB2(P<0.05)，在含0.5%NaCl的BHI培养基中LM90SB2△lmo0331生长趋势显著高于LM90SB2(P<0.05)。提示Lmo0331蛋白对细菌的耐碱有重要作用。 4. lmo0331基因缺失对LM90SB2毒力的影响 为了探究lmo0331基因对LM毒力的影响，比较了LM90SB2△lmo0331与LM90SB2对不同细胞系的粘附侵袭能力和对小鼠毒力以及在小鼠肝脏、脾脏和脑中定植能力的差异。结果显示：LM90SB2△lmo0331 缺失株对多种细胞系的粘附侵袭能力有所下降。LM90SB2△lmo0331 对 RAW264.7、MBMEC、SIEC、HBMEC 的粘附能力显著下降（P<0.05）；LM90SB2△lmo0331对RAW264.7、MBMEC的侵袭能力显著下降（P<0.05）。小鼠感染试验显示 lmo0331 基因缺失后 LM90SB2 的毒力下降，LM90△lmo0331 与LM90SB2 相比 LD50 提高了 0.97 个数量级。在小鼠感染后不同时间点， LM90SB2△lmo0331在肝脏和脑内的载菌量均显著低于LM90SB2，在脾脏中只有在48 h时显著低于野毒株的载菌量。提示表面蛋白Lmo0331参与LM90SB2对小鼠的毒力。