研究背景多囊卵巢综合征(PCOS)是常见的内分泌及代谢紊乱性疾病,主要表现为卵巢多囊样改变、稀发排卵或无排卵,以及高雄激素血症。其中,卵泡内雄激素过多可致卵泡闭锁,最终至卵巢多囊样改变,而PCOS所伴发的胰岛素抵抗又可使膜细胞对LH增敏致雄激素合成亢进。PCOS患者高雄激素来源于卵巢和肾上腺,并以卵巢膜细胞来源为主。为研究PCOS高雄激素血症发生发展的分子机制,课题组早前研究中比较了 PCOS患者行楔形切除术后获得的卵巢组织(n=3)与正常育龄妇女因变性需求切除的卵巢(n=3)组织中表达的差异基因,发现SET(patient SE translocation)基因在PCOS患者卵巢中高表达,表达量较正常妇女增高2倍以上。RT-PCR及Western Blot实验亦证实SET基因及蛋白的高表达。免疫组织化学结果提示,SET定位于女性卵泡膜细胞及卵母细胞。此前,本课题组首次在窦前卵泡和膜细胞中证实,SET通过抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A),增强包括3β羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)和细胞色素P450 17α羟化酶(P450c17)在内的雄激素合成酶的mRNA水平,并正向调控P450c17裂解酶活性。同时,作为转录因子(Transcription factor,TF),SET激活下游CYP17A1(编码P450c17的基因)转录,最终导致雄激素合成增加,参与PCOS高雄血症的发生。因此,SET蛋白通过PP2A通路导致PCOS高雄血症发生的作用机制在本课题组已经研究的较为透彻。那么,在PCOS发生发展中,SET基因高表达(2倍以上)究竟是为什么,SET基因上游调节的机制如何?这些问题,目前还鲜有研究报道。SET基因的高表达是PCOS的病因机制还是由于病理变化所导致的结果,也是一个亟待解决的问题。明确SET上游调控网络,将最终阐明SET在PCOS发生发展中的关键作用,明确SET在PCOS高雄激素血症中的病理生理功能,也为创新的PCOS生物学治疗提供思路。SET基因,又名模板激活因子1,于1992年以SET-nup214融合基因的形式发现于一例急性白血病患者,参与转录调控、核小体装配、组蛋白修饰和细胞周期等多个生物过程。作为原癌基因,SET在多种肿瘤细胞中高表达,促进肿瘤细胞的增殖。在阿尔茨海默症(Alzheime’s disease,AD)中,SET基因高表达于患者神经元细胞,促进神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTS)。这提示SET在不同组织、多种疾病中发挥重要的生理、病理作用。检索UCSC数据库发现:通过可变剪切,SET产生4个剪切异构体,4者分别有不同的转录起始位点并由不同的启动子起始转录。其中,1号(SETα)与2号(SETβ)剪切异构体在人体内表达峰度较高。有研究发现,与SETα相比,SETβ在不同组织细胞中表达量相对恒定。在猪睾丸及蟾蜍卵母细胞中,SETβ为主要存在形式;在Jurkat、PEER等早期造血谱系细胞中,仅发现SETβ蛋白的表达。另外,SETβ促进DNA复制、染色质转录及解聚的活性均明显高于SETα,是SET蛋白发挥生物学活性的主要形式。已发现NF-κB及Spl可以转录激活SETα表达;迄今为止,对SETβ上游转录调控的研究还未有报道。鉴于SETβ人体内表达峰度高、为卵巢中的主要存在形式、SETβ活性高于SETα等因素,我们确立SETβ及其调控为本文研究的中心。目的1.阐明SET基因启动子及其表达调控机制鉴定人SET基因2号剪切异构体(SETβ)的启动子并寻找其关键活性区域;分析核心启动子,筛选、鉴定调控SET基因启动子活性的关键转录因子ZFX;验证转录因子ZFX与SET启动子的结合,明确结合的顺式作用元件。2.通过临床标本验证转录因子ZFX对SET基因的调节检测关键转录因子ZFX及SET在PCOS患者及正常妇女卵巢中的表达及细胞定位。在子宫内膜异位症(EMs)中,检测在位内膜细胞、异位内膜细胞及正常子宫内膜细胞中ZFX和SET的表达水平,验证ZFX-SET轴并分析其增殖调控作用。方法第一部分人SET基因启动子分析1.利用 promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)数据库及启动子标志(H3K4Me3,Pol-II)确定SET/β基因的启动子区域。2.以HeLa细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法获取SET基因5’侧翼启动子序列,定向插入pGL3-Basic荧光素酶报告基因表达载体。将获得的启动子质粒转染入HeLa和HEK293细胞。运用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性。3.采用PCR方法获取SET基因5’端顺序缺失启动子序列,定向插入pGL3-Basic表达载体。双荧光素酶报告基因检测系统确定SET启动子最小活性区域。4.Genomatix(http://www.genomatix.c om/cgi-bin//eldorado/main)及 Jarspar(http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar)数据库分析人 SET 基因核心启动子序列,预测核心启动子区潜在的转录因子结合位点。5.各转录因子表达质粒及启动子质粒共转染后,行双荧光素酶报告基因检测,初步分析预测的数个转录因子对SET启动子活性的调控。第二部分 ZFX对人SET基因的转录调控1.利用RNA干扰、转录因子过表达,验证关键性转录因子ZFX对SET启动子活性的调控作用。2.Jarspar(http://iaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar)数据库预测人 SET 基因核心启动子区ZFX顺式作用元件;利用突变技术及RNA干扰、转录因子过表达试验,明确ZFX调控SET表达的顺式作用元件。3.染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecitation,ChIP)及创新性的Transient ChIP实验证实关键转录因子ZFX与SET启动子序列的结合,明确结合的顺式作用元件。第三部分 在PCOS等疾病验证ZFX-SET的调节1.收集PCOS患者(n=3)及正常妇女卵巢(n=3),石蜡包埋、切片后行免疫组化分析转录因子ZFX与SET蛋白在卵巢中的细胞定位。2.实时定量荧光PCR分析在子宫内膜异位症患者在位内膜与异位内膜中关键转录因子ZFX与SET的表达水平。MTT实验检测ZFX对子宫内膜基质细胞生长的调控。结果第一部分 人SET基因启动子分析SET基因通过可变剪切产生SETα及SETβ,其中SETβ启动子活性高于SETα。SETβ启动子基因启动子位于转录起始位点上游855 bp至下游139 bp(-855/+139 bp);从-855 bp缺失到-157 bp,启动子序列仍具有较高活性,但当缺失到+47 bp时,活性基本与阴性对照质粒pGL3-Basic相当,提示SET启动子最小活性区域位于-137/+47 bp,在该区域存在重要的转录激活因子的顺式作用元件。第二部分 ZFX对人SET基因的转录调控生物信息学预测SET核心启动子区包含了以下转录因子结合位点:E2F1、E2F3、E2F4、EGR1、SP1、ZFX和NRF1。转录因子过表达实验表明E2F3抑制SET的启动子活性(p<0.05),与对照组相比,启动子活性降低35%;ZFX,E2F4对SET启动子活性起转录激活作用,启动子活性分别升高1.8及2.3倍(p<0.05);SP1、E2F1、EGR1及NRF1对SET启动子活性无调控作用(p>0.05)。ZFX对SET启动子的转录激活作用最为显著,且为剂量依赖式。SET核心启动子区有4个可能的ZFX结合位点(-146/-133,-99/-86,-93/-80以及-69/-56bp),将4个结合位点分别突变后,超表达及抑制试验均证实4号位点(Site4,CAGGCCAATGGCGC,-69/-56bp)为 ZFX 调控 SET 启动子的关键性作用位点,而1-3号位点突变并不影响SET启动子活性。突变实验,结合ChIP和Transient ChIP实验证实ZFX与SET启动子上Site4顺式作用位点结合。第三部分 ZFX-SET调控轴参与PCOS等SET相关疾病在正常妇女卵巢及PCOS患者卵巢中,SET与转录因子ZFX共定位,均定位于卵巢膜细胞及卵母细胞。在子宫内膜异位症患者,在位内膜及异位内膜细胞ZFX及SET表达均较对照组正常子宫内膜细胞升高(p<0.05),且异位内膜组表达量较在位内膜组升高(P<0.05)。MTT实验证实ZFX促进子宫内膜基质细胞生长。结论1.人SETβ核心启动子位于-137/+47 bp,该区域存在SP1、E2F1、EGR1、ZFX、E2F4及E2F3等转录因子结合位点。E2F3抑制SET的启动子活性;ZFX,E2F4对SET启动子活性起转录激活作用;SP1、E2F1、EGR1及NRF1对SET启动子活性无调控作用。2.转录因子ZFX显著增强SET基因启动子活性,且该作用为计量依赖性。ZFX通过与 SET/β 启动子区 Site4(-69/-56 bp)CAGGCCAATGGCGC 顺式作用元件结合,转录激活SET表达。3.利用临床标本,验证了在PCOS及正常妇女卵巢中,ZFX与SET共定位于膜细胞及卵母细胞,提供了 ZFX-SET调控轴参与PCOS高雄激素血症发生的组织学基础。最后,PCOS和子宫内膜异位症两种疾病模型中SET、ZFX表达水平的一致,说明ZFX-SET轴广泛存在,在不同疾病中发挥作用。4.本课题首次获得了人SETβ基因核心启动子区域,该序列的阐明将为PCOS及其他SET基因相关疾病的病理生理研究奠定基础;同时本实验明确了SETβ基因上游转录激活因子ZFX,扩展了 ZFX蛋白功能。SET作为PCOS高雄激素血症的核心因子,其上游调控网络的完善,能够为包括PCOS高雄激素血症在内的SET相关疾病,提供新的治疗思路。