蛋白磷酸化过程在生物体的各项生命活动过程中都有着重要作用。磷酸化过程的异常与现代很多疾病密切相关,例如癌症,糖尿病,心脏病等。蛋白激酶和蛋白磷酸酶作为磷酸化以及去磷酸化过程中两种非常重要的酶,在控制磷酸化过程中起着重要作用,因此发展新型的、免标记的蛋白激酶及蛋白磷酸酶检测手段不仅对于我们了解细胞代谢以及相应的生命过程很有价值,而且对于临床药物的开发也有着重要意义。绿色荧光蛋白是由238个氨基酸构成的具有自发荧光的特性的生物发光蛋白,其作为融合标签被广泛应用于分子生物学和细胞生物学领域。随后发展的基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术由于其较好生物相容性以及不需要额外荧光标记的优势,在检测蛋白与蛋白之间相互作用,蛋白的可溶性表达方面均有着较多的应用。但是目前,双分子荧光互补技术在蛋白磷酸化过程检测中应用还非常少,因此,将此技术成功应用至磷酸化的检测不仅丰富了磷酸化的检测方法也扩展了双分子技术在生物传感领域的应用。本文基于绿色荧光蛋白的双分子荧光互补技术,在重组型绿色荧光蛋白1+10互补对自组装的基础上,开发了基于磷酸化调控的半合成荧光蛋白的免标记蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性检测新方法。主要工作如下:1.分别通过分子克隆,构建绿色荧光蛋白大片段重组质粒的手段单独表达大片段以及通过胰蛋白酶酶切完整蛋白,尿素变性以及分子筛去除尿素复性方法获取大片段,并对两种方法进行比较,选择效率最佳的方法来获取大片段,并将制备的大片段应用至后续分析检测体系中。2.基于第一章中构建的绿色荧光蛋白大片段tGFP与S10片段的复合体系,通过设计合成S-peptide,即在S10片段C端引入一条磷酸化的底物多肽,借助羧肽酶CPY对磷酸化多肽的抑制作用,经PKA磷酸化后的多肽不能被CPY酶切,因此能够与大片段很好复合,产生荧光信号,以大小片段复合后的荧光强度为响应信号,对蛋白激酶PKA活性进行检测。体系对PKA活性检测的检测限为0.5m U/μL,通过H-89抑制剂来评估激酶抑制作用,其IC50值为23.4 nM。除此之外,该方法还能用于对细胞裂解液中蛋白激酶活性进行分析。3.通过对S-peptide多肽进行功能化修饰,在第二章合成的S-peptide的基础上引入磷酸化基团,同样借助CPY对磷酸化和非磷酸化多肽的识别作用,经PP1酶去磷酸化的多肽能够被CPY酶切,不能与大片段复合,没有荧光信号,因此与PP1的活性呈现负相关,以大小片段复合后的荧光为检测信号,对蛋白磷酸酶PP1的活性进行检测。该方法能够灵敏的检测蛋白磷酸酶PP1的活性,检测限为0.06m U/μL,我们的分析方法以半合绿色荧光蛋白作为信号输出,操作简单、免标记、灵敏。此方法有潜力成为一种通用的蛋白激酶活性检测平台。