金花梨芽变单系筛选及分子生物学鉴定研究

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梨属于蔷薇科(Rosaceae)、梨属(Pyrus)植物。全世界有梨属植物30多个种,分为东方梨和西洋梨两大系统。目前全世界有76个国家生产梨,中国是世界梨的主要原产地和栽培地,其栽培面积和产量已连续10年居世界第一,是梨的产业大国。梨产业的发展对调整我国农业产业结构、增加农民收入等都具有十分重要的意义。梨普遍存在芽变现象,且多自发产生,可通过调查研究,从中筛选优质高产的新品系或新品种,这是目前梨研究的重要工作之一,也是积极适应国际市场和主动应对WTO竞争的需要。金花梨(Pyrus Brestchneideri Nak cv Jinhua)是四川省的科技工作者在金川县从金川雪梨的实生变异中选出的优良品种,目前已在全国推广栽培,是四川梨的主栽品种,其栽培面积和产量约占四川栽培梨的30%左右。但在较长时期大面积金花梨的栽培过程中,发现金花梨具有果实大小不均,特别是果实偏大,质地稍粗,品质差异较大等缺点。因此对金花梨的芽变单系进行筛选和鉴定,属于优中选优,筛选比金花梨更为优秀的品系或品种,将对梨产业发展产生重要影响,对梨的科学研究与生产实践都具有十分重要的理论和实践意义。 本研究以经过较长时间初步选出的18个金花梨芽变单系(以下按1至18的编号顺序,分别简称为J1,J2,J3,……和J18)为试材,采用生物学观测法、调查总结研究法、田间试验和实验室分析法等方法,以金花梨(简称J)为对照,对该18个芽变单系的物候期、生长结果习性、果实经济性状等进行了观测与分析;并对各单系从表现型方面进行了形态学筛选与鉴定;并以梨的幼嫩叶和成熟叶为材料,探讨了梨DNA的提取方法,建立了梨RAPD(Random Aplified Polymorphic DNA,随机扩增多肽性DNA)的技术体系,并利用RAPD技术,分析了梨的遗传多样性;对18 个芽变单系的POD(Peroxidase,过氧化物酶)同工酶进行了分析;采用RAPD技术对这些单系从遗传方面进行了DNA分子标记鉴定。其主要结果如下: 门人通过对18个金花梨芽变单系的表现型观测,初步筛选出山、J。、J4、J。、J;。、J;。、J;。、J1s8个b金花梨优良的单系。金花梨在大面积推广栽培过程中,极易发生变异,18个变异单系都在原金花梨的基础上不同程度地发生了表型和遗传变异,有些变异单系如人、J3、J4、JS的果实比金花梨提早10天左右成熟,是一个有益变异,可从中筛选比金花梨提早成熟的品系或品种。金花梨果实为广倒卵圆形,而有些单系如人小J1。在果形上出现多种性状,特别是圆形果实属于好的变异现象,可从中进一步筛选理想的圆形果实品系或品种。综合形态学观察、POD及RAPD的分析鉴定结果,其综合性状优良的单系有J卜J3、J4、JS、JI卜JI小JI巾Jls,有望从中筛选出产量、品质等综合性状优于金花梨或在某一(些)方面有突出特点的变异新品系或新品种。本文己对这二个单系的生物学特性进行了详细描述。拟将这百个单系作为进一步研究筛选的材料,其余各单系将作为后备材料待用。 Q人 以梨成熟叶为材料,经POD同工酶分析表明,供试的18个变异单系和金花梨的POD同工酶酶谱之间存在着一定的差异,主要表现在酶带数量和酶活性上的差异。从酶带数量看,JZ、人、Jll、J;,4个单系增加了1条A产带,J。减少了1条Cj带,J;卜JI,减少了1条Aj带,表明它们在酶的种类上发生了变异,已不同于原金花梨品种的酶带。结合田间调查和室内测试分析结果推断A产带的增加和C卜Aj带的减少与金花梨综合性状发生劣变有关。从酶活性看,人、J13、J14、J18单系的AZ弱带强于其它单系:而J14、J15、J16单系的A3弱带强于其它单系;JI、J3、人单系的O酶带相对较强;JZ、J7单系的CI酶带相对较弱;而J4、J13、J18的CZ酶带较强。这表明它们的酶学特性发生了变异。结合田间调查和室内测试分析结果可判断这些酶带活性的增强与金花梨综合性状的优变有关。POD同工酶分析结果表明,金花梨及其变异单系间的差异是受基因型决定的,非环境所致。酶谱差异主要表现在酶带数量和酶活性两个方面。供试单系4条特征酶带基本相同,仅个别变异单系增加或减少了12条弱带。 门X 通过对梨基因组DNA提取方法的探讨,改良CTAB (Ctnyltriethylammonium Bromide,十六烷基三甲基演化胺)法和改良 SDS 2(Sodium Dodecyl Sulfate,十一烷基硫酸钠)法都能提取梨基因组mA。改良CTAB法是快速提取高质量、高纯度梨基因组DNA的首选方法。该研究筛选改良 CTAB法的最佳条件是:ig新鲜材料提取液以 5ml最适宜,65oC浸提的临界时间是 30’,65oC恒温时间为二小时。在该条件下能获得RAPD所需的高质量、高纯度DNA,且DNA产率大。改进的SDS法提取的DNA模板也可用于RAPD分析,而且具有操作简便、成本低、省时等特点,也值得采用。 N人对梨DNA提取材料进行了探讨,采用改良SDS法,以梨成熟叶为材料成功提取了DNA,并有效克服了氧化问题。由于梨幼嫩叶的取材时间相对较短,一般仅能延续一周左右
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