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目的:通过观察蝎毒多肽提取物(PESV)及联合化疗干预小鼠H22肝癌移植瘤自噬相关蛋白及血管生成相关通路蛋白表达和肿瘤血管密度的变化,明确PESV和联合化疗对肿瘤自噬的影响和抗血管生成作用,探讨PESV联合雷帕霉素通过肿瘤自噬抑制H22肝癌移植瘤生长的机制,为其临床抗癌应用提供依据。方法:1.建立H22肝癌皮下荷瘤模型,随机分为荷瘤对照组、PESV组、化疗(Rapamycin)组和联合治疗(PESV+Rapamycin)组。测量肿瘤体积并计算抑瘤率,描绘肿瘤体积增长曲线,观察PESV对H22肝癌移植瘤生长的影响。2.常规HE染色,光镜下观察H22肝癌组织病理变化。3.VIII因子标记肿瘤微血管,检测H22肝癌组织微血管密度(MVD),观察PESV、化疗以及PESV联合化疗对H22肝癌血管生成的影响。4.免疫荧光及免疫组化法检测各组H22肝癌组织中m TOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A的变化。5.Western blot法检测各组H22肝癌组织中m TOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A的表达。结果:1.蝎毒多肽提取物对小鼠H22肝癌移植瘤生长的影响与荷瘤对照组相比,PESV组、Rapamycin组、联合组肿瘤生长速度较荷瘤对照组受到明显抑制(P<0.05,P<0.01),肿瘤重量降低,抑瘤率分别为29.2%,17.7%和44.8%。联合治疗组和Rapamycin组抑瘤作用最强,瘤重显著较低,与荷瘤对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);与Rapamycin组比较,联合组的瘤重和肿瘤体积亦均存在显著差异(P<0.05)。2.HE染色观察各组H22肝癌移植瘤组织标本的形态HE染色显示,联合组可见大面积坏死区,有较多的核碎裂、核固缩等凋亡和坏死的形态学改变;PESV组和Rapamycin组亦有明显坏死,但坏死程度相对减轻;荷瘤对照组坏死区较少,且坏死面积较小,肿瘤细胞生长良好,少见坏死及凋亡等形态学变化。3.各组肿瘤组织MVD的表达变化免疫组织化学染色显示,VIII因子标记血管内皮细胞,细胞胞浆染色阳性,呈棕黄色,微血管散在分布。与荷瘤对照组相比,Rapamycin组、PESV组、联合治疗组MVD表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与Rapamycin组相比,联合组明显降低(P<0.05)。4.免疫荧光及免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织m TOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A蛋白表达冰冻切片荧光显微镜观察显示,m TOR、HIF-1α和VEGF-A的对照组中可见明显的绿色荧光,干预组的荧光相比之下有不同程度的降低;ULK1和LC3A的联合用药组中有明显的绿色荧光,而其它组较低。免疫组织化学染色显示,m TOR、VEGF-A、ULK1和LC3A主要表达于肿瘤细胞胞浆,以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性,HIF-1α表达于细胞核和胞浆中,以出现棕黄色或褐色为阳性。经半定量图像灰度值分析,三个干预组m TOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表达平均灰度值高于对照组(P<0.05,P<0.01),蛋白表达量低于对照组(P<0.05,P<0.01);ULK1、LC3A蛋白平均灰度值高于对照组,蛋白表达量均高于荷瘤对照组(P<0.05)。联合用药组与Rapamycin组比较,m TOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表达减少,ULK1、LC3A蛋白表达增多(P<0.05)。5.Western blot检测各组肿瘤组织m TOR、HIF-1α、VEGF-A、ULK1和LC3A蛋白表达Western blot半定量检测结果显示,与荷瘤对照组相比,三个干预组m TOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表达条带均减弱(P<0.05),ULK1、LC3A蛋白表达条带增强(P<0.05)。联合用药组与Rapamycin组比较,m TOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白表达减少,ULK1、LC3A蛋白表达增多(P<0.05)。结论:1.PESV及PESV联合Rapamycin能够抑制H22肝癌移植瘤生长,联合作用优于单独用药。2.PESV及PESV联合Rapamycin能够抑制H22肝癌移植瘤的血管生成,这可能与抑制m TOR、HIF-1α、VEGF-A蛋白的表达有关;联合作用优于单独用药。3.PESV及PESV联合Rapamycin能够增强H22肝癌细胞的自噬,促进ULK1、LC3A蛋白的表达;联合作用优于单独用药。