背景和目的：　　皮肤黑色素瘤是一种严重的皮肤肿瘤疾病，通常发生在黑色素细胞改变和恶化的情况下。尽管近些年来癌症的发病率呈逐渐下降的趋势，但黑色素瘤的发病率却呈逐年增长的趋势，全球每年因其死亡人数约为五万人，在年轻人中致死率特别高。尽管在发病早期通过外科手术切除黑色素瘤5年的成活率达到了99%以上，但是末期发生肿瘤扩散的情况下其成活率骤降到低于10%。　　BRAF基因突变标志着细胞水平紊乱发展的开始，黑色素细胞的增生，通过CDKN2A的突变或外生性沉默（周期性蛋白依性激酶抑制剂），并且伴随着一系列的p16功能性缺失、NRAS基因突变激活、干细胞生长因子失常等过程，会导致黑素细胞的增殖、凋亡和癌变。目前，黑色素瘤的主要治疗方法有外科手术、放射疗法和化疗。然而，较低的响应率和明显的毒副作用使得患有黑色素瘤的病人无法有效使用这些治疗方法。所以进一步开发安全有效的治疗手段是十分必要的。　　Roomi等人曾经报道脯氨酸具有对抗大量细胞系的抗癌作用。他们证实了Rath等人的假设，该假设认为细胞外基质（ECM）的破坏对于癌症细胞的入侵、生长和转移具有关键的作用，使用蛋白酶解的血纤维蛋白溶酶抑制剂，如赖氨酸和脯氨酸，能够阻止这些过程。作为一个应力基质，脯氨酸被认为通过基质金属蛋白酶（MMPs）能够分解细胞外基质微环境中的胶原质。此外，这种依靠于脯氨酸的过程，在某种意义上就是一种被称作自噬的功能。事实上，黑色素瘤自噬过程的异常已经能够从恶性黑色素瘤LC3-II的免疫组织化学检测中反映出。另一个相关的研究方向针对于色素上皮细胞衍生因子（PEDF）的对照，色素上皮细胞衍生因子是丝氨酸蛋白酶抑制剂总科中的一种，其具有抗血管生成和抗癌细胞转移的活性，该研究结果表明缺氧能够致使PEDF的水平降低，这是由于自我吞噬而产生的作用和后续由于在自我吞噬过程中PEDF的减少所产生的影响。以上提到的研究指出了低氧下自噬和黑色素瘤转移具有潜在联系，然而，大量的研究针对依靠脯氨酸的相关手段，或者针对人体黑色素瘤的自噬过程，而针对于将这两者综合考虑的研究却非常的少。　　在本研究中，我们力图揭示在人体黑色素瘤A375细胞系中，依靠脯氨酸促进这些黑色素瘤细胞自噬的活性。我们希望通过我们的研究，能够提高对于通过依靠脯氨酸在黑色素瘤细胞上作用的相关分子机理的理解。　　方法：　　在研究的实施当中我们关注于PYCR2的水平，PYCR2能够催化吡咯啉-羧酸（P5C）进入到脯氨酸中，在黑色素瘤细胞中也大量有PYCR2存在。PYCR2的表达通过RNAi对照，A375细胞系的细胞增殖通过甲基噻唑基四唑测试（MTT）进行检测。PYCR2对于细胞自噬和蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路的作用，其评价是通过荧光激发细胞分选（FACS）实验和蛋白质印迹实验（Western blot）进行的。　　结果：　　一、通过PYCR2过表达载体和RNAi对PYCR2进行表达对照　　通过pcDNA3.1-PYCR2载体和siRNA处理，都会对在人体黑色素瘤A375细胞系中的PYCR2的表达产生影响。两种溶剂对于PYCR2水平的作用与对照组的水平显著不同。细胞被特定PYCR2-siRNA和PYCR2表达载体进行处理后的PYCR2的表达水平与空白组相比没有区别。　　二、PYCR2的负调控阻止A375细胞增殖和引导其自噬　　相对于对照组，通过甲基噻唑基四唑比色法实验（MTT）的结果，A375细胞系的增值能力没有明显地被PYCR2的过表达所影响。然而，在介入siRNA后， A375细胞系的增殖能力显著的被抑制了，且其效果具有依时性。类似模式也从FACS的结果中观察到；对比其它三组，通过PYCR2的沉默显著地增加了A375细胞系的自噬比率。MTT比色法和流式细胞仪的结果都暗示：通过PYCR2的沉默导致黑色素瘤细胞中发生了自噬过程。　　三、使用蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路激活siRNA来实现对PYCR2的沉默　　为了更进一步确定PYCR2的沉默是否需要蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路的参与，我们对p-AMPKα、p-mTOR和LC3三种蛋白质产物使用蛋白质印迹法进行定量。结果显示经过siRNA的瞬时转染导致了pAMPKα和LC3-II有效的正调控；通过PYCR2沉默阻止了p-mTOR的合成；LC3-I的表达不受该处理的影响。以上过程都与细胞自噬过程相联系。我们也使用了AMPK抑制剂化合物C来证实活化路径，研究结果表明，不管单独使用AMPK抑制剂化合物C还是与PYCR2-siRNA共同作用，通过处理均可以显著抑制pAMPKα和LC3-II的表达。接着我们开展了针对CHL-1的类似实验，LC3-I的表达没有被影响，但是LC3-II却由于PYCR2的沉默导致了正调控。这些研究结果表明PYCR2的沉默能够在人体黑色素瘤细胞系中激活蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路（AMPK/mTOR），如A375和CHL-1。　　四、通过蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路沉默PYCR2导致自噬　　我们进一步分析了通过蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路（AMPK/mTOR）与黑色素瘤细胞系A375的自噬之间的联系，使用3-MA作为自噬的抑制剂。PYCR2的沉默有助于LC3-II表达的正调控，与上述结果相一致。仅仅使用3-MA不能对LC3-I或 LC3-II的表达起作用，但是它会压制黑色素瘤细胞系A375细胞自噬的正调控，这些结果表明siPYCR2诱导的AMPK/mTOR信号通路与黑色素瘤细胞系A375的自噬相关，意味着可以通过激活蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白信号通路使PYCR2沉默并导致自噬。　　结论：　　在A375细胞系中PYCR2的沉默导致了A375细胞的自噬，而且是通过AMPK/mTOR信号通路导致了自噬。然而，PYCR2基因的过表达似乎在细胞自噬和靶向路径方面没有影响。我们的研究可以说明PYCR2有潜力作为治疗黑素瘤的治疗靶点。我们在将来将进一步开展依靠PYCR2的作用来提升治疗黑素瘤治疗效果的研究。