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甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤。甲状腺癌的发病率在世界范围内增加，美国甲状腺癌发病率相关APC(%)(annual percentage change (APC)在1980-1997期间是2.4，而1997-2009年间增长至6.6(SEER.cancer.gov)。BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌中最常见的突变形式，可以引起丝裂原活化的蛋白激酶通路（MAPK）的激活和持续活化，导致细胞无限分裂和肿瘤生成。BRAFV600E突变与甲状腺癌的淋巴结转移、腺外浸润侵袭、临床分期、恶性程度相关，伴有BRAFV600E突变的甲状腺癌患者预后相对较差。因此，甲状腺癌患者伴有BRAFV600E突变时，需要给予更大范围的甲状腺癌切除术及放射性碘治疗。放射性碘治疗可以消除患者甲状腺癌切除术后的残余甲状腺及转移癌组织。甲状腺癌多为多中心病灶，即使是高分化的甲状腺癌也是如此，所以给予甲状腺癌患者放射性碘治疗对于预防甲状腺癌复发有很好的作用。钠碘同向转运体基因（NIS）是甲状腺细胞中介导碘摄取的膜蛋白，是碘摄取的关键基因。但是在伴有BRAFV600E突变的甲状腺癌中钠碘同向转运体NIS表达水平降低或者膜蛋白定位不好引起功能丧失。因此很多患者失去了使用放射碘治疗的机会，患者的甲状腺癌复发风险增大。钠碘同向转运体NIS在伴有BRAFV600E突变的甲状腺癌中表达水平降低的机制直不是很清楚。组蛋白乙酰化是组蛋白翻译后修饰的种，调节染色质重构。组蛋白乙酰化可以使染色质解聚，转录因子更容易结合在DNA上，促进转录，激活基因表达；相反，组蛋白去乙酰化后染色质结构紧缩，转录因子不容易结合在DNA上，转录抑制，基因沉默。组蛋白乙酰化主要发生在组蛋白H3、H4的N末端比较保守的赖氨酸残基上，H3N末端的乙酰化位点Lys4， Lys9， Lys14， Lys18和Lys23；H4的乙酰化位点主要发生在Lys5，Lys8，Lys12和Lys16。根据不同的乙酰化位点在肿瘤中的作用如：前列腺癌组织中组蛋白H3lys9乙酰化水平降低，促进肿瘤的发展，在胃癌、卵巢上皮癌中其降低导致患者预后不好；H3lys14乙酰化水平在肿瘤细胞中水平降低，可能是导致治疗耐药的原因；在低分化前列腺癌病人中H3K18低乙酰化水平和肿瘤高复发率相关，提示组蛋白的乙酰化修饰可能和药物抵抗有关；组蛋白H4lys16乙酰化水平降低与多种肿瘤细胞耐药相关，而且在多种肿瘤组织及细胞中明显减少[1]。甲状腺癌中BRAFV600E突变可以下调NIS基因表达，组蛋白乙酰化水平降低下调钠碘同向转运体NIS表达水平，但是BRAFV600E突变是否通过调节组蛋白乙酰化水平影响钠碘同向转运体NIS基因表达以及可能的机制还不清楚。我们的课题主要是探讨BRAFV600E突变的甲状腺癌中组蛋白乙酰化对钠碘同向转运体NIS表达的影响。组蛋白的翻译后修饰在不同物种如酵母、小鼠、大鼠和人类中相对保守和稳定，因此我们选择大鼠正常的甲状腺细胞PCCL3，诱导表达或者瞬时转染BRAFV600E进行研究。PCCL3/BRAF细胞是稳定转染了人BRAFV600E质粒，需要使用DOX1ug/ml进行诱导表达；PCCL3细胞进行空白对照、野生型BRAF和BRAFV600E质粒的瞬时转染。此外，我们还选择了本身含有BRAFV600E突变的人甲状腺癌细胞BCPAP进行实验验证及机制研究。对组蛋白乙酰化水平的研究，我们选择组蛋白H3K9/14，H3K18，total H4，H4K16等乙酰化位点进行检测。在大鼠正常甲状腺细胞PCCL3中诱导和瞬时转染BRAFV600E，明确BRAFV600E突变及其对NIS表达的影响。方面在细胞总体水平检测组蛋白乙酰化水平的改变；另方面，检测大鼠NIS基因启动子不同区域组蛋白乙酰化位点H3K9/14，H3K18，total H4，H4K16乙酰化的改变。人甲状腺癌细胞BCPAP中，MAPK抑制剂AZD6244，BRAF抑制剂PLX40321um处理48小时，抑制MAPK信号通路，检测人钠碘同向转运体NIS启动子不同区域乙酰化位点H3K9/14，H3K18，total H4，H4K16的乙酰化改变。实验中组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理PCCL3/BRAF和BCPAP细胞作为组蛋白乙酰化水平改变的阳性对照。大鼠钠碘同向转运体NIS启动子区域划分为7段区域：EXON(-20/104)， P1(-297/-107)，P2(-477/-277)，P3(-678/-452)，P4(-1124/-950)，P5(-1874/-1713)，NUE(-2627/-2342)。人钠碘同向转运体NIS启动子区域划分为5段区域EXON(42/399)， P1(-692/-370)，P2(-1147/-762)，P3(-1511/-1216)，NUE (-9525/-9287)。运用染色质蛋白免疫共沉淀CHIP技术检测大鼠钠碘同向转运体NIS启动子区域组蛋白不同乙酰化位点乙酰化水平的改变。结果显示BRAFV600E突变体在PCCL3/BRAF细胞和PCCL3细胞表达时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因mRNA表达水平在48h降低了50%到60%。细胞总体组蛋白乙酰化水平略有增加。染色质蛋白免疫共沉淀CHIP结果显示大鼠钠碘同向转运体NIS启动子区域：PCCL3/BRAF细胞诱导表达BRAFV600E突变时，组蛋白H3K9/14乙酰化位点在P1，P2和P3区域乙酰化水平降低，然而PCCL3细胞瞬时转染BRAFV600E突变时外显子EXON和P1区域H3K9/14乙酰化水平降低。在PCCL3/BRAF细胞中SAHA可以提高大鼠NIS启动子P1, P3，P4和NUE区域H3K9/14乙酰化水平。在PCCL3/BRAF和PCCL3细胞中，BRAFV600E突变仅影响H3K18和总H4大鼠NIS启动子P1和P2区域乙酰化水平。DOX1ug/ml诱导BRAFV600E突变时，大鼠钠碘同向转运体NIS基因启动子区域P1和P2部分H4K16的乙酰化水平降低，然而细胞核上游增强子NUE区域乙酰化有轻度的增高。在PCCL3细胞中瞬时转染BRAFV600E突变体仅降低了大鼠NIS启动子区域P3和P5部分的H4K16位点乙酰化水平。人甲状腺癌细胞BCPAP中，MAPK抑制剂AZD4244，BRAF抑制剂PLX40321um处理细胞48小时，人钠碘同向转运体NIS启动子区域P1部分H3K9/14和H4K16乙酰化水平升高，SAHA提高P1和P2区域H3K9/14乙酰化水平及整个启动子区域的H4K16乙酰化水平。由以上结果我们总结： BRAFV600E突变时，组蛋白乙酰化水平的改变主要发生在大鼠钠碘同向转运体NIS启动子的主要功能区域P1，P2和P3部分，其中组蛋白H3K9/14和H4K16位点的乙酰化水平改变更明显。总体上来说，当BRAFV600E突变时，在大鼠钠碘同向转运体NIS启动子的主要功能区域H3K9/14，H3K18，总H4,H4K16乙酰化水平降低，H3K9/14，H4K16的乙酰化可能在调节大鼠钠碘同向转运体NIS表达中发挥更显著的作用。BRAFV600E突变对钠碘同向转运体NIS启动子区域乙酰化水平的影响可能是通过MAPK信号通路。我们的研究证实了伴有BRAFV600E的甲状腺癌患者钠碘同向转运体NIS基因表达降低可能是因为BRAFV600E突变下调钠碘同向转运体启动子主要功能区乙酰化水平，MAPK信号通路也在该调节中发挥作用。此研究为日后特异性靶向药物治疗伴有BRAFV600E突变的甲状腺癌患者提供理论依据。