天然免疫应答是宿主抵御病毒入侵的第一道防线。I型干扰素作为主要的抗病毒效应分子在宿主体内广泛表达,参与宿主免疫调控并诱导抗病毒效应。而病毒为了有效的增殖和感染往往进化出多种策略拮抗I型干扰素反应,逃避机体的抗病毒防御。猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)是一种新型细小病毒,常在发生仔猪多系统衰竭综合征、腹泻和呼吸道疾病的猪群中检出,易与猪蓝耳病毒、猪二型圆环病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒发生共感染,被认为具有潜在的免疫抑制功能。PBoV编码两个非结构蛋白(NS1、NP1)和两个结构蛋白(VP1、VP2),但这些蛋白在调控宿主免疫防御中的作用鲜有报道。本研究以PBoV编码蛋白为研究对象,发掘出NP1蛋白具有干扰素拮抗和诱导炎症功能,通过研究NP1调控宿主免疫防御系统的机制,为阐明PBoV的致病机理和免疫逃逸策略奠定基础,并部分还原PBoV在感染过程中所扮演的角色。具体研究内容包括:1.PBoV NP1负调控I型干扰素产生细小病毒科病毒广泛感染不同宿主,然而其免疫逃避策略鲜有报道。本研究利用双荧光素酶筛选到PBoV非结构蛋白NP1能够显著抑制IFN-β启动子活性以及IFN-β和IFN-α等干扰素相关基因的转录。通过对RLR信号通路研究,发现NP1靶向IRF3或其下游分子,并且对IRF3表达、磷酸化、转核等过程均无影响。其通过阻遏IRF3与IFN-β启动子的结合抑制I型干扰素产生。2.PBoV NP1负调控I型干扰素信号级联病毒进化出多种策略抑制干扰素的信号转导。本研究利用双荧光素酶报告系统,筛选到PBoV NP1蛋白显著抑制干扰素激活反应元件ISRE的活化以及下游干扰素刺激因子ISG的表达。通过对JAK-STAT信号通路研究,发现NP1对转录因子STAT1/STAT2的表达、磷酸化及转核均无影响,并且不影响转录因子复合物ISGF3的形成。其通过与ISGF3复合物发生互作影响ISGF3与ISRE的结合。3.PBoV NP1拮抗IRF3和IRF9启动子结合的分子机制尽管一些多效性病毒蛋白可以同时靶向干扰素的产生和信号转导环节,但是鲜有蛋白被报道通过广谱机制同时靶向IRF3及IRF9。通过免疫共沉淀实验发现PBoV NP1同时与IRF3及IRF9互作,并且与IRF3及IRF9的DNA结合域发生互作。细节研究表明,NP1与IRF3及IRF9 DNA结合域上关键氨基酸位点发生直接互作,影响IRF3和IRF9的启动子结合活性。综上,这些结果表明PBoV NP1采用广谱互作机制,同时抑制干扰素的产生及其信号级联,拮抗I型干扰素反应。4.PBoV NP1诱导NF-κB活化一些具有干扰素拮抗作用的病毒同时诱导NF-κB激活,促进其介导的炎症反应以及免疫抑制因子的表达。双荧光素酶及定量试验显示,PBoV NP1诱导NF-κB启动子活化,并且促进其下游的促炎因子表达。通过对NF-κB活化过程研究,发现NP1通过诱导IκBα降解,增加p65磷酸化,促进p65活化转核。5.PBoV NP1亚细胞定位及免疫调控区域研究PBoV NP1蛋白具有I型干扰素应答调控功能,然而其相应功能域仍不清楚。通过构建多个NP1突变体与GFP融合表达质粒进行荧光观察,发现NP1 N-端1-66氨基酸区域包含两个经典核定位信号序列和一个非经典核定位信号序列。利用双荧光素酶实验,发现NP1 N-端氨基酸区域同时参与调控干扰素的产生及信号级联。此外,结果显示,NP1 C-端168-218氨基酸区域直接参与NF-κB调控,并且经典核定位信号区显著增强了其NF-κB调控活性。这些结果表明,PBoV NP1蛋白在其N-和C-端氨基酸区域包含与两个独立的功能域,分别与亚细胞定位或干扰素拮抗以及NF-κB调控相关。6.噬菌体展示系统筛选与PBoV NP1相互作用的宿主蛋白NP1是博卡病毒属的独有编码蛋白,其功能并不完全清楚。NP1与宿主的相互关系仍需深入了解。在本研究利用原核表达系统,得到纯化的NP1蛋白,并通过T7噬菌体表面展示系统筛选与NP1互作的宿主蛋白。通过序列比对,在筛选阳性克隆中鉴定出与NP1发生互作的两个宿主蛋白,锌指蛋白APA-1和磷脂酰丝氨酸合成酶1。