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口蹄疫(Foot-and-mouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)引起的以感染牛、猪、羊等偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病,严重危害畜牧业生产、国民经济和人民生活,世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的多种动物共患传染病之一。FMDV非结构蛋白3A蛋白在病毒复制中起重要作用,可作为宿主细胞受小RNA病毒感染的标志,而且3A蛋白与病毒的致病力和宿主范围有关;3B蛋白在FMDVRNA复制合成时起引物的作用。感染动物体内产生高水平的抗3AB蛋白抗体,而在疫苗免疫的动物体内基本不产生,因此,通过免疫3AB蛋白制备抗FMDV3AB的单克隆抗体,既为FMD鉴别诊断提供物质基础,又为深入研究3AB蛋白及其相关联的蛋白的功能奠定了基础。
本研究构建了重组表达载体pET-30a(+)-FMDV-3AB,并在大肠杆菌表达系统中实现了可溶性表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化3AB,Westernblot证实3AB可与FMDVAsia1型的牛阳性血清发生特异性反应,证实表达的融合蛋白具有较好的抗原性。然后以纯化的3AB蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3B蛋白和6株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1B2、1G8、1E11、4A3、4A4、5C9、5D7、9H9和10D1,并对这9株单抗进行了生物学鉴定。亚类鉴定结果显示,182和1E11为IgM,1G8为Ig2a,其余均为IgG1亚类,轻链均为κ型。间接免疫荧光试验结果表明,这9株单抗均能够识别FMDV3AB蛋白。用制备的单克隆抗体对分段表达的3AB蛋白进行Westernblot分析,结合位点分别位于3A的第55aa～70aa、64aa～79aa、130aa～145aa区段,3B的第17aa～31aa、49aa～63aa和25aa～39aa内。利用单抗4A3和1B2株,分析了Asia1型FMDV感染BHK-21过程中3A、3B蛋白随时间动态变化的情况。
本研究制备了抗FMDV3A和FMDV3B单抗,并对其相应抗原表位区域进行研究,为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法提供了物质基础,也为进一步探索3AB蛋白的结构和功能奠定了基础。