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亚甲蓝(Methylene blue,MB)是一种广泛应用于生物和医学领域的一种吩噻嗪盐,研究表明MB在线粒体中可以充当电子载体增强呼吸链功能,减轻细胞线粒体损伤、改善氧化应激和提高线粒体中ATP生成。目前尚未见亚甲蓝对生殖细胞保护作用的研究报道。因此,本研究旨在探讨亚甲蓝对猪卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation,IVM)和孤雌胚胎体外发育的影响,为进一步优化猪卵母细胞体外成熟体系提供理论依据。首先探讨IVM液添加不同浓度MB(对照组:0nM;试验组:10nM、50nM、100nM、200nM)处理40h-44h后对猪卵母细胞的影响。通过统计卵丘细胞扩展情况及卵母细胞第一极体排出率、MⅡ期卵母细胞孤雌激活后早期胚胎卵裂率、囊胚率,得出较优MB处理浓度。结果显示,体外成熟培养液中添加10nmol/L浓度MB组的卵丘细胞扩展分值(2.588±0.018)和卵母细胞第一极体排出率(69.73±3.56)显著高于0nmol/L对照组(2.372±0.029、60.13±3.31)(P<0.05);随后,孤雌激活早期胚胎发育后显示,10nmol/L处理组的卵裂率(84.24±1.7)和囊胚率(34.54±3.56)均显著高于对照组0nmol/L(75.71±3.24、25.69±3.85)(P<0.05),但其余各添加组和对照组的卵裂率和囊胚率相比无显著差异(P>0.05)。其次根据各浓度MB的处理效果,选择10nmol/L的MB浓度处理猪卵母细胞44h-46h,进一步探讨其可能的作用机制。结果发现:相比0nmol/L对照组,10nmol/L的MB处理组可以显著降低卵母细胞内活性氧的荧光强度(12.8±3.28VS 7.5±3.19,P<0.05);10nmol/L MB处理组可以显著提高卵母细胞内总谷胱甘肽含量(13.95±2.78 VS 11.86±1.28,P<0.05)和线粒体膜电位水平(13.42±3,98VS 20.7±2.67,P<0.05)。并在对卵母细胞母系基因的表达中发现,添加10nmol/L的MB处理组可以显著提高卵母细胞内CyclinB1、SHMT2、PGC1α的表达(P<0.05);对C-MOS、CDC2、ELASTIN的表达作用效果不显著(P>0.05)。研究结果表明:(1)在猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚发育阶段,添加10nmol/L亚甲蓝能有效促进卵母细胞的成熟及后续的孤雌胚胎发育。(2)亚甲蓝可能通过以下途径发挥作用以促进卵母细胞成熟:促进卵丘细胞增殖、扩展、降低细胞凋亡,维持正常的生理活动;清除卵母细胞内自由基,提高卵母细胞内氧化系统的抗氧化能力;提高卵母细胞内线粒体活性,使线粒体增加更多的生物合成,以便于提供卵母细胞成熟过程中所需的物质,提高其质量。