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实验目的:
为改善外伤性视神经损伤后的修复障碍,利用静电纺丝法制备具有三维立体结构和药物缓控释的神经修复载药膜片.通过在损伤处局部给药的方式来保护残存的视网膜神经节细胞(RetinalGanglionCells,RGCs)和促进视神经轴突再生.通过理化表征和体外药物释放行为,筛选出适合载药的复合载药膜片.通过细胞实验和动物实验初步探明复合载药膜片是否能短期抑制视神经损伤处炎症介质的释放、延缓视网膜神经节细胞凋亡和增加神经生长相关蛋白的表达,以期达到更理想的治疗效果,为临床治疗视神经损伤提供新思路及实验依据.
实验方法:
1.以医用高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolideacid),PLGA)和胶原蛋白(Collagen,COL)为原材料,通过静电纺丝技术制备4种不同比例(PLGA、PLGA∶COL=3∶1、PLGA∶COL=1∶1、PLGA∶COL=1∶3)具有微孔结构纳米纤维层的静纺膜,通过微观结构、亲水性、力学性能、降解性、生物相容性等性能等调整工艺参数,优选两种比例构建双层复合载药膜片.
2.通过溶液共混载入模型药物法舒地尔,观察不同载药浓度对静纺膜理化性能的影响,筛选出合适的载药浓度.将法舒地尔(Fasudil,Fa)与曲安奈德(TriamcinoloneAcetonide,TA)共同包载于复合膜片中,通过药物体外释放实验,检测载药膜片的药物释放行为及药物代谢动力学,制备复合载药膜片.
3.采用transwell细胞培养板共培养实验,运用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CellCountingKit-8,CCK-8)细胞毒性活性检测法和Live/Dead细胞活性测定法,观察原代RGCs在载药材料环境下细胞活性、形貌和轴突延伸的情况,评价复合载药膜片的细胞相容性及药物对RGCs细胞存活率及形态的影响.
4.将所制备复合载药视神经修复膜片植入到大鼠视神经损伤模型中,通过免疫荧光染色视网膜铺片计数,比较各实验组损伤后RGCs凋亡情况;通过病理组织苏木素-伊红染色(HematoxylinandEosin,HE)切片染色,观察损伤后炎症反应;通过免疫组化技术,比较各实验组神经生长相关蛋白的表达,评估复合载药修复膜片对损伤后视神经的修复效果.
实验结果:
1.PLGA/COL在保证胶原含量最大化的前提下得到稳定良好的PLGA/COL(3/1)电纺膜,其具有合适的断裂伸长率与弹性模量,作为里层材料,其良好的亲水性可作为脂溶性药物TA的载体;作为外层材料的PLGA电纺膜,在实验分组中拥有最大的抗拉强度的力学支撑,其疏水性特征可作为亲水性药物的载体,改善水溶性药物在基质中药物突释现象.通过连续的分层电纺技术制作复合载药膜片,其力学性能、亲水性、生物相容性以及体外药物释放的结果都符合植入载药材料标准.
2.原代RGCs细胞与复合载药膜片运用transwell板共培养,RGCs细胞生长状态良好,说明复合载药膜片具有良好的生物相容性.与对照组细胞相比,具有延缓视网膜神经节细胞凋亡的效果,Live/Dead染色实验显示细胞形态轴突生长更显著.
3.将复合载药膜片植入大鼠视神经钳夹伤模型,对视神经损伤进行局部修复,视网膜免疫荧光铺片结果提示复合载药膜片在短期内能延缓视网膜神经节细胞的凋亡,病理HE染色提示复合载药膜片组释放的TA药物能有效地控制损伤后炎症,免疫组化结果提示复合载药膜片组释放的法舒地尔药物能提高神经生长相关蛋白(Growth-AssociatedProtein,GAP-43)的表达.
实验结论:
1.复合载药缓释膜片具有较好的微观结构、亲水性、机械性能、降解性、及良好的生物相容性,能缓慢控制释放所包载的药物.
2.复合载药缓释膜片与视网膜神经节细胞体外共培养能延缓视网膜神经节细胞的凋亡.
3.初步研究复合载药缓释膜片通过在视神经损伤处缓慢释放药物,能在短期内可改善和控制损伤处的炎症反应,增加GAP-43的表达,延缓视网膜神经节细胞的凋亡.
4.局部给药形式对损伤后视神经具有一定的保护作用和修复疗效.
为改善外伤性视神经损伤后的修复障碍,利用静电纺丝法制备具有三维立体结构和药物缓控释的神经修复载药膜片.通过在损伤处局部给药的方式来保护残存的视网膜神经节细胞(RetinalGanglionCells,RGCs)和促进视神经轴突再生.通过理化表征和体外药物释放行为,筛选出适合载药的复合载药膜片.通过细胞实验和动物实验初步探明复合载药膜片是否能短期抑制视神经损伤处炎症介质的释放、延缓视网膜神经节细胞凋亡和增加神经生长相关蛋白的表达,以期达到更理想的治疗效果,为临床治疗视神经损伤提供新思路及实验依据.
实验方法:
1.以医用高分子材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(D,L-lactide-co-glycolideacid),PLGA)和胶原蛋白(Collagen,COL)为原材料,通过静电纺丝技术制备4种不同比例(PLGA、PLGA∶COL=3∶1、PLGA∶COL=1∶1、PLGA∶COL=1∶3)具有微孔结构纳米纤维层的静纺膜,通过微观结构、亲水性、力学性能、降解性、生物相容性等性能等调整工艺参数,优选两种比例构建双层复合载药膜片.
2.通过溶液共混载入模型药物法舒地尔,观察不同载药浓度对静纺膜理化性能的影响,筛选出合适的载药浓度.将法舒地尔(Fasudil,Fa)与曲安奈德(TriamcinoloneAcetonide,TA)共同包载于复合膜片中,通过药物体外释放实验,检测载药膜片的药物释放行为及药物代谢动力学,制备复合载药膜片.
3.采用transwell细胞培养板共培养实验,运用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CellCountingKit-8,CCK-8)细胞毒性活性检测法和Live/Dead细胞活性测定法,观察原代RGCs在载药材料环境下细胞活性、形貌和轴突延伸的情况,评价复合载药膜片的细胞相容性及药物对RGCs细胞存活率及形态的影响.
4.将所制备复合载药视神经修复膜片植入到大鼠视神经损伤模型中,通过免疫荧光染色视网膜铺片计数,比较各实验组损伤后RGCs凋亡情况;通过病理组织苏木素-伊红染色(HematoxylinandEosin,HE)切片染色,观察损伤后炎症反应;通过免疫组化技术,比较各实验组神经生长相关蛋白的表达,评估复合载药修复膜片对损伤后视神经的修复效果.
实验结果:
1.PLGA/COL在保证胶原含量最大化的前提下得到稳定良好的PLGA/COL(3/1)电纺膜,其具有合适的断裂伸长率与弹性模量,作为里层材料,其良好的亲水性可作为脂溶性药物TA的载体;作为外层材料的PLGA电纺膜,在实验分组中拥有最大的抗拉强度的力学支撑,其疏水性特征可作为亲水性药物的载体,改善水溶性药物在基质中药物突释现象.通过连续的分层电纺技术制作复合载药膜片,其力学性能、亲水性、生物相容性以及体外药物释放的结果都符合植入载药材料标准.
2.原代RGCs细胞与复合载药膜片运用transwell板共培养,RGCs细胞生长状态良好,说明复合载药膜片具有良好的生物相容性.与对照组细胞相比,具有延缓视网膜神经节细胞凋亡的效果,Live/Dead染色实验显示细胞形态轴突生长更显著.
3.将复合载药膜片植入大鼠视神经钳夹伤模型,对视神经损伤进行局部修复,视网膜免疫荧光铺片结果提示复合载药膜片在短期内能延缓视网膜神经节细胞的凋亡,病理HE染色提示复合载药膜片组释放的TA药物能有效地控制损伤后炎症,免疫组化结果提示复合载药膜片组释放的法舒地尔药物能提高神经生长相关蛋白(Growth-AssociatedProtein,GAP-43)的表达.
实验结论:
1.复合载药缓释膜片具有较好的微观结构、亲水性、机械性能、降解性、及良好的生物相容性,能缓慢控制释放所包载的药物.
2.复合载药缓释膜片与视网膜神经节细胞体外共培养能延缓视网膜神经节细胞的凋亡.
3.初步研究复合载药缓释膜片通过在视神经损伤处缓慢释放药物,能在短期内可改善和控制损伤处的炎症反应,增加GAP-43的表达,延缓视网膜神经节细胞的凋亡.
4.局部给药形式对损伤后视神经具有一定的保护作用和修复疗效.