利用双向凝胶电泳分离视网膜蛋白质组中的蛋白点，并运用串联质谱技术成功地鉴定出其中一些蛋白质。实验结果证实，通过比较视网膜组织生理和病理状态下2-D胶上蛋白质“点”的变化，分离表达差异有统计学意义的“点”进行质谱鉴定，可寻找与视网膜疾病相关的差异蛋白，为研究其发病机理、筛选药物靶标以及临床诊断和治疗提供重要的理论与实验依据。目的：1．建立并优化大鼠视网膜蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳(two-dimensioned electrophoresis，2-DE)技术，以提高其分辨率及重复性。2．观察8周病程糖尿病大鼠视网膜组织形态及其蛋白质表达变化情况。3．比较正常和8周病程糖尿病大鼠视网膜的蛋白质表达差异，运用串联质谱鉴定差异蛋白点并进行生物信息学分析，初步揭示糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)发生中可能的分子病理机制。方法：1．用四氧嘧啶(Alloxan)腹腔内注射健康雌性SD大鼠构建糖尿病模型。八周后处死动物，立即取出眼球或视网膜用作组织切片、电镜观察或蛋白质组学分析。2．对正常和糖尿病大鼠视网膜做普通切片和超薄切片，分别在光镜和电镜下观察其组织病理变化特征。3．从视网膜中提取蛋白质并纯化和测定蛋白质浓度，经固相pH梯度等电聚焦、平衡、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶染色和图像扫描，建立正常视网膜及8周糖尿病大鼠视网膜蛋白质表达谱。对影响2-DE结果的各种因素进行调整、优化。4．用PDQuest 7.3.1软件进行图像剪切和优化处理，以及点的检测和计数，分析糖尿病性视网膜的蛋白质的差异表达情况。5．对表达差异有统计学意义的蛋白质进行胶内原位酶解和串联质谱(tandem mass spectrometry，MS／MS)鉴定，所得结果用GPS-MASCOT进行数据库检索。6．对鉴定出来的蛋白质进行生物信息学分析。7．探讨差异表达蛋白质在糖尿病大鼠视网膜病变过程中的作用，以及它们的临床意义。结果：1．8周病程糖尿病大鼠的视网膜光镜结构和超微结构未见明显改变。2．成功获得了糖尿病大鼠视网膜及正常视网膜组织蛋白质的双向凝胶电泳图谱，建立了稳定的2-DE技术。3．经分析比较获得36个表达差异有统计学意义(P＜0.05)的蛋白质点，包括上调5个，下调23个，消失8个。4．对其中8个差异表达的蛋白点进行质谱鉴定，其中表达上调的有晶状体蛋白βA1(预测)(predicted crystallin beta A1)和晶状体蛋白αB(Crystallin alpha B)，表达下调的有白蛋白(albumin)、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2，DDAHⅡ)、磷酸丙糖异构酶-1(triosephosphate isomerase 1，TIM-1)、ATP合酶d链(ATPsynthase, H~+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit d)和鸟苷酸激酶-1(预测)(predicted guanylate kinase 1，GK-1)，表达消失的有过氧还原素6(Peroxiredoxin 6，Prdx 6)。5．差异表达谱生物信息学分析结果显示，作为小热休克蛋白的晶状体蛋白αB为细胞保护的分子侣伴蛋白，在细胞骨架的保护和调节以及抗凋亡方面有重要作用。我们首次报道了它在糖尿病视网膜组织中高表达，可能作为DR诊治和预后的重要生化标记物。白蛋白是哺乳动物脉管系统中最丰富的转运和贮存蛋白，可调节血浆胶体渗透压，增大血管内径，尤其是小动脉或毛细血管。它在抗氧化方面和NO信号转导过程中有重要作用。在糖尿病视网膜组织中低表达的白蛋白可能影响到血浆胶体渗透压和NO信号转导，加重视网膜细胞死亡，最终导致失明。二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2(DDAHⅡ)能水解二甲基精氨酸(ADMA)和一甲基精氨酸(MMA)，从而影响NO的产生，糖尿病大鼠视网膜中DDAHⅡ的下调能增加ADMA，降低NO合成，保护视网膜细胞免受高血糖的损伤。磷酸丙糖异构酶-1(TIM-1)参与糖酵解，糖分解成丙酮酸盐的反应链涉及到10种酶，其中TIM-1为第5种酶，能将DHAP转化为GAP。高血糖能增加TIM-1的硝化，导致TIM-1的低表达，从而减少了ATP的合成。TIM-1有可能作为DR诊治的有用标记物。鸟苷酸激酶-1(GK-1)能催化ATP依赖的GMP变成GDP，参与GMP循环，最终影响cGMP的水平，在视杆细胞的感光换能过程中起了重要作用。糖尿病视网膜组织中低表达的GK-1增加了GMP水平，使cGMP蓄积，最终影响到神经冲动的产生，这有可能是DR致盲的一种可能机制。ATP合酶d亚单位能催化合成ATP，但具体功能不清。糖网病视网膜中ATP合酶d亚单位的低表达会使ATP合成减少，影响到视网膜细胞的功能。过氧还原素6(Prdx 6)是唯一同时具有GSH过氧化物酶和磷脂酶A2活性的双功能蛋白，能防止氧化应激。糖尿病视网膜中Prdx 6的消失可能会加重组织的氧化损伤。晶状体蛋白βA1与眼内压的增高有关，但在非晶状体组织中的作用目前尚不清楚。结论：1．已建立的视网膜蛋白质2-DE技术将为进一步开展视网膜疾病的蛋白质组学研究奠定基础。2．8周病程糖尿病大鼠视网膜未见明显组织结构改变，但已经有蛋白质表达的差异，提示糖尿病视网膜的蛋白质表达改变先于组织学改变。3．这些表达有差异的蛋白质，包括晶状体蛋白αB、白蛋白、DDAHⅡ、TIM-1、GK-1、Prdx 6和ATP合酶d链等，在细胞骨架保护和调节、抗凋亡、抗氧化、NO信号转导、感光换能作用、糖酵解、ATP合成、氧化应激等方面起着重要作用，可能参与糖尿病视网膜病变的发病机制，有助于糖尿病视网膜病变的诊断和治疗。4．早期糖尿病大鼠视网膜组织学结构无明显变化，但蛋白质表达出现较大的变化，涉及的蛋白质种类较多，与以往基因组研究结果基本一致。结果再次提示血糖增高可导致视网膜内代谢和光传导障碍，甚至氧化应激反应。要确定这些变化的临床意义，以及它们在糖尿病视网膜病变中所起的作用还有大量工作要做。