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目的:肝功能衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害,是临床常见的严重肝病症候群,病死率极高。多年来,各国学者对肝衰竭的发病机制不断进行探索,目前尚未完全阐明。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)为糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3)的亚型。最新研究证实,GSK3参与炎症的进程,其中GSK3β影响转录因子NF-κB的活性。本研究旨在通过检测GSK3β在肝衰竭的表达,探讨GSK3β对肝衰竭病情演变的影响。方法:1动物实验通过D-氨基半乳糖(D-Galactosamine,D-Gal N)腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)模型。检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transam inase,AST)、总胆红素(Total bilirubin,TB)、凝血酶原时间(Prothrombintime,PT)水平;部分肝组织石蜡包埋后切片,用于苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝脏病理变化;余肝组织经液氮速冻后,-80℃冰箱保存,用于实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)检测肝组织GSK3βm RNA表达,免疫组织化学染色法检测肝组织GSK3β、p-GSK3β的表达及分布,Western blot检测肝组织GSK3β、p-GSK3β的表达。2临床实验选取2015年1月至2015年10月河北医科大学第三医院门诊或住院患者,共47例,其中慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者22例(CHB组)、HBV相关慢加急性肝功能衰竭(Acute on chronic liver failure,ACLF)患者25例(ACLF组),另外同期于河北医科大学第三医院体检中心选取20例健康体检者作为健康对照(Healthy control)组。除此之外,收集接受肝移植的ACLF患者肝组织12例、肝组织活检的CHB患者肝组织23例及正常供体肝组织4例。检测入组患者血清ALT、ˉAST、TB、DB、INR、HBV DNA水平;酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)检测患者血清p-GSK3β、TNFα水平;RT-PCR检测肝组织GSK3βm RNA表达;免疫组织化学染色法检测肝组织GSK3β、p-GSK3β表达及分布;Western blot检测肝组织GSK3β、p-GSK3β的表达。结果:1动物实验部分1.1成功构建小鼠肝衰竭模型实验结果可见正常对照组小鼠毛发有光泽,精神状态好,饮食量多;肝衰竭组小鼠毛发凌乱没有光泽,饮食量、活动减少,精神欠佳,反应迟钝。1.2小鼠血清生化指标肝衰竭组小鼠血清ALT、AST、TB、PT水平高于正常对照组(P均<0.01)。1.3肝组织病理学改变正常对照组:肝小叶结构清晰,以中央静脉为轴,肝细胞索呈放射状排列,肝细胞结构完整,大小均匀,无变性及坏死,无炎细胞浸润;肝衰竭组:肝小叶结构紊乱,肝细胞索消失,可见多处出血坏死灶,坏死灶可见细胞核的碎裂及坏死并有大量炎细胞浸润。1.4肝组织GSK3βm RNA的表达肝衰组小鼠肝组织GSK3βm RNA表达水平较正常对照组明显升高(P<0.01)。1.5肝组织GSK3β、p-GSK3β的分布与表达免疫组织化学染色结果显示:GSK3β、p-GSK3β主要表达于肝细胞胞浆。Western blot结果显示:正常对照组、ALF组小鼠肝组织GSK3β表达水平无明显差异(P>0.05);ALF组小鼠肝组织p-GSK3β蛋白表达较正常对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2临床实验部分2.1各组研究对象年龄及性别比例具有可比性。ACLF组患者血清ALT、TB、DB、INR水平明显高于CHB组及健康对照组(P<0.01);ACLF组患者Alb则明显低于CHB组及健康对照组(P<0.01);ACLF组和CHBˉ组AST水平、HBV DNA载量无明显差异(P>0.05)。2.2血清TNFα与p-GSK3β水平CHB组血清TNFα水平较正常对照组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);ACLF组TNFα水平较正常对照组、CHB组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。CHB组血清p-GSK3β水平较正常对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.01);ACLF组p-GSK3β水平较正常对照组、CHB组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.3肝组织GSK3βm RNA的表达CHB组GSK3βm RNA表达水平较正常对照组无明显差异(P>0.05);ACLF组GSK3βm RNA表达水平较正常对照组、CHB组明显升高(P<0.01),差异具有统计学意义。2.4肝组织GSK3β、p-GSK3β的分布与表达免疫组织化学染色结果显示:GSK3β、p-GSK3β主要表达于肝细胞胞浆。蛋白印迹法结果显示:正常对照组、CHB组、ACLF组患者肝组织GSK3β表达水平无明显差异(P>0.05);CHB组p-GSK3β表达水平较正常对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.01);ACLF组p-GSK3β表达水平较正常对照组、CHB组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.5 ACLF患者血清p-GSK3β与TNFα相关性分析ACLF患者血清p-GSK3β与TNFα呈负相关,相关系数为r=-0.761(P<0.01)。结论:1 GSK3β通过调节磷酸化/去磷酸化水平参与了肝衰竭的病理生理过程。2 HBV相关ACLF患者GSK3β活性增强,TNFα表达升高,提示GSK3β在HBV相关ACLF中发挥作用,推测其机制可能通过上调TNFα合成和(或)分泌,影响疾病进程。