恶性胶质瘤是人类最常见、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM),IV级胶质瘤,因具有快速增殖、密集侵袭、基因改变和血管生成增加等特点,而使其成为恶性胶质瘤中的最恶性肿瘤。尽管在神经成像、神经外科技术、放疗和化疗方面取得了一定的进展,但在过去几十年里,胶质母细胞瘤患者的总体生存率仍然不容乐观。胶质母细胞瘤患者的中位生存时间为15-18个月,仅比30年前多几个月。胶质母细胞瘤的5年总生存率为~5.1%。其中关键的制约因素可能是缺乏对胶质母细胞瘤发生发展的分子机制的理解。因此,进一步寻找有用的生物标志,探索新靶点和更好地定义胶质母细胞瘤发病机制对于延长胶质母细胞瘤患者生存期是迫切需要的。CSN复合体(COP9 signalsome,CSN)是普遍存在于植物和动物中由八个亚基(CSN1-CSN8)组成的结构高度保守的信号复合体。在哺乳动物中,CSN复合体与26S蛋白酶体复合体具有相似的氨基酸序列,因此推测其在蛋白降解途径中发挥重要的作用。已有研究报道CSN复合体中第六个亚基(CSN6)在调节蛋白酶体的活性中发挥重要的作用。最近研究发现CSN6在调控细胞进程如细胞周期,DNA损伤修复和肿瘤的成瘤性中发挥重要作用。CSN6在人类癌症中如宫颈癌、结直肠癌或乳腺癌都显著高表达,暗示CSN6可能在肿瘤发展中发挥作用。然而在胶质母细胞瘤中有关CSN6的生物学功能和分子机制还未有研究报道。本论文的研究目标是利用分子生物学、细胞生物学、分子病理学等技术,探究CSN6在胶质母细胞瘤中扮演的角色,阐释CSN6调控胶质母细胞瘤增殖和转移的分子机制,主要研究结果如下:(1)CSN6的高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关为了确定CSN6表达是否是患者不良预后的指标,我们首先使用免疫组织化学实验检测揭示CSN6在人胶质母细胞瘤中的表达显著高于相邻正常脑组织。然后,我们检测了5种胶质母细胞瘤细胞系(包括LN-229,U-87 MG,U-251 MG,U-118MG和A172)中的CSN6表达。我们发现CSN6在这五种胶质母细胞瘤细胞系中普遍表达。为了进一步确定CSN6是否与胶质母细胞瘤患者预后相关,我们分析了来自在线的R2临床数据平台中Tumor-Glioma-French-284数据库的预后数据。我们发现CSN6的表达与胶质瘤病人的预后密切相关。综上所述,CSN6在胶质母细胞瘤中的表达显著高于正常脑组织,并且CSN6的高表达与患者的不良预后相关。(2)CSN6调控胶质母细胞瘤细胞的增殖能力为了研究CSN6在胶质母细胞瘤细胞增殖中的重要性,我们首先利用慢病毒介导的shRNA技术下调胶质母细胞瘤细胞U-87 MG和LN-229中CSN6的表达。首先通过BrdU实验发现CSN6下调的细胞中DNA复制的细胞数目显著减少。然后通过流式细胞分析发现CSN6下调后可促使细胞周期阻滞在G1期。最后,MTT实验也证实CSN6下调后可显著抑制细胞的生长。为了探索下调CSN6促使细胞周期阻滞的分子机制,我们检测了与G1期相关的周期蛋白表达。结果发现在CSN6下调细胞中CDK4,CDK6和CyclinD的表达明显减少。为了进一步证实CSN6下调对细胞增殖的影响不是脱靶或病毒效应,我们在CSN6下调细胞中再过表达CSN6以达到恢复CSN6表达的目的。通过一系列功能实验表明CSN6过表达可以恢复细胞的增殖能力,表明下调CSN6对细胞增殖的抑制作用是由于胶质母细胞瘤细胞中CSN6表达的下调所致。这些结果表明CSN6对于胶质母细胞瘤细胞增殖是必需的。(3)CSN6调控胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力为了研究CSN6是否调控胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力,我们进行了Transwell实验。当在U-87 MG和LN-229细胞中下调CSN6表达后细胞的迁移侵袭能力明显低于对照组。另外,划痕实验检测也表明在CSN6下调后细胞的迁移能力显著降低。为了明确CSN6下调对细胞迁移和侵袭的影响,我们进行Western blot实验检测与迁移侵袭相关基因的表达。结果发现在U-87 MG和LN-229细胞中CSN6的下调降低了间充质标志物(SNAIL1,SNAIL2,N-cadherin和ZEB1)以及上皮-间充质细胞转化(EMT)标志物(β-catenin)的表达,并增加上皮标志物(E-cadherin)的表达。此外,金属蛋白酶(MMP13)的表达也显着降低,而MMP1的表达没有观察到明显变化。随后在CSN6下调细胞中再恢复CSN6的表达后可以挽救细胞的迁移和侵袭能力。这些结果表明CSN6对胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭有重要的作用。(4)CSN6调控胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力以及成瘤能力为了研究CSN6表达对胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力和肿瘤形成能力的影响,我们进行了软琼脂克隆形成实验和小鼠脑原位移植实验。在软琼脂克隆形成实验中,与对照组相比,下调CSN6后细胞形成的克隆更小且更少。在小鼠脑原位移植实验中,与对照组小鼠相比,注射CSN6下调后的细胞的裸鼠中肿瘤生长显著迟缓。免疫组化实验显示CSN6下调组的肿瘤样品中CSN6表达显著降低。此外,Ki-67的表达也明显降低。当在CSN6下调的细胞中再过表达CSN6时,我们发现这些细胞的克隆形成能力和肿瘤形成能力也可以被挽救回来。这些结果表明CSN6是胶质母细胞瘤发展所必需的。(5)CSN6通过减少EGFR泛素化来激活EGFR介导的信号传导途径EGFR在胶质母细胞瘤细胞中高表达,并且EGFR通过其下游信号通路加速了重要的细胞进程,如细胞增殖和迁移侵袭等。厄洛替尼是一种小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂,可抑制肿瘤细胞的生长和转移。为了探究CSN6对胶质母细胞瘤细胞的增殖和转移作用是否依赖于EGFR通路,我们用厄洛替尼(100μM)处理了U-87 MG-CSN6细胞,LN-229-CSN6细胞以及它们的对照组细胞。MTT实验分析表明厄洛替尼显著降低了CSN6对细胞增殖的促进作用。Transwell实验表明厄洛替尼明显降低了CSN6对细胞迁移和侵袭的促进作用。其次Western blot实验表明EGFR磷酸化水平随胶质母细胞瘤细胞中总EGFR蛋白水平的改变而改变。为了进一步验证我们的数据,我们测量了EGFR下游通路中AKT和ERK的相对磷酸化。结果显示,CSN6过表达后AKT和ERK的磷酸化显著增加,通过厄洛替尼处理则明显减少,表明CSN6通过EGFR介导的信号传导途径促进胶质母细胞瘤细胞的增殖和转移。通过Western blot实验发现在CSN6下调的细胞中EGFR水平显著降低,但是实时定量PCR分析显示CSN6下调并不影响EGFR的mRNA水平,表明CSN6可能在转录后水平调节EGFR的表达。通过加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)之后,检测发现CSN6过表达可降低EGFR的降解速率。为了进一步研究CSN6对EGFR稳定性的影响,我们检测了EGFR的泛素化水平,发现CSN6过表达之后减少了EGFR的泛素化。这些结果表明CSN6通过减少EGFR的泛素化降解调节EGFR的稳定性进而激活EGFR介导的信号传导途径。(6)CSN6调节E3泛素连接酶CHIP的蛋白降解进而稳定EGFR的表达之前已有研究报道CSN6具有调节E3泛素连接酶稳定性的功能。而已知的调控EGFR降解的E3泛素连接酶,包括CBL,PARK2和CHIP,它们都在人类恶性肿瘤中发挥重要的作用。为了确定CSN6是否调节这些E3泛素连接酶的表达,我们通过Western blot实验发现CHIP的表达与CSN6呈负相关。其次通过免疫共沉淀实验发现CSN6与CHIP相互作用。最后通过构建各种截短形式的载体以及进一步的免疫共沉淀实验发现CSN6的N-末端区域与CHIP的N-末端区域相结合,这些结果表明CSN6与CHIP相互作用并调节CHIP的表达,从而稳定EGFR。然而实时定量PCR数据表明CSN6并不影响CHIP的mRNA水平,表明CSN6可能在转录后水平调节CHIP的表达。通过加入蛋白酶体抑制剂MG-132之后发现CSN6介导的CHIP下调可被MG-132恢复。为了进一步证实CSN6在转录后水平调节CHIP的表达,我们检测了加入CHX后CHIP蛋白的降解速率。结果表面,与对照组相比,CSN6下调后CHIP蛋白的降解速率下降。此外,体外泛素化实验也表明,CSN6过表达显著增加了CHIP的泛素化。这些结果表明CSN6通过增强对CHIP的泛素化降解来调控EGFR的稳定性。(7)在CSN6下调的细胞中再次下调CHIP可以部分恢复CSN6对胶质母细胞瘤增殖和转移的抑制作用之前Western blot实验已经表明CSN6下调可以增加CHIP的表达,所以我们推测CHIP可能是胶质母细胞瘤细胞中CSN6的下游效应因子。为了验证这一假设,我们在CSN6下调细胞中再下调CHIP,Western blot实验表明在CSN6下调细胞中再下调CHIP表达后EGFR的表达增加。同时,再次下调CHIP后,CSN6下调引起细胞的增殖,迁移和侵袭能力也明显恢复。此外,软琼脂克隆实验表明,与CSN6下调组相比,CSN6下调细胞中再下调CHIP组中细胞的克隆更大且更多。此外,使用小鼠脑原位移植实验也表明在CSN6下调的细胞中再次下调CHIP可以部分恢复细胞的成瘤能力。总之,这些结果表明CHIP是CSN6的一个关键下游效应因子,并且CSN6-CHIP轴通过调控胶质母细胞瘤中的EGFR信号传导途径促进细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤性。总之:在本研究中,我们发现CSN6的高表达与胶质母细胞瘤患者的不良预后相关,CSN6通过EGFR介导的信号通路促进胶质母细胞瘤细胞增殖,迁移和侵袭。其中CSN6参与调节EGFR蛋白的稳定性,并且CSN6的下游因子CHIP是调控EGFR泛素化降解的关键E3泛素连接酶。CSN6-CHIP轴的失调会促进胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。因此,我们的研究为CSN6作为新的胶质母细胞瘤的治疗靶标提供了理论基础和实际意义。