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胰腺星状细胞(Pancreatic stellate cells, PaSCs)是位于啮齿类动物和人类胰腺腺泡细胞,导管细胞和血管内皮细胞周围的星形细胞。它在调节胰腺腺泡细胞功能,细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)更新和维持组织结构中起了重要作用。整合素受体能够整合ECM信号,对于细胞的功能和生存有重要作用,并且参与胰腺内分泌腺和外分泌腺的发育。但是整合素受体信号对人胎儿PaSCs的作用还尚未阐述。本研究探讨β1整合素与Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)相互作用对胎儿胰腺星状细胞功能和增殖的影响及其相关的信号通路。第一部分人胎儿胰腺星状细胞的分离和鉴定目的：明确胎儿胰腺PaSCs在胰腺组织内的形态和分布,分离、培养并鉴定胎儿PaSCs。方法：(1)收集人类胎儿胰腺(8-21周胎龄),新鲜分离的胰腺组织立即处理用于电镜和/或免疫组化,以及分离原代细胞。(2)制备半薄(500 nm)和超薄(60nm)胰腺切片,电镜和相差显微镜观察PaSCs的形态和位置。(3)免疫荧光双标染色(PaSC markers/insulin, PaSC markers/CK19)评价PaSCs在胰腺的分布。(4)组织外生培养法分离原代胎儿PaSCs。(5)相差显微镜观察PaSCs的外生和形态,免疫荧光染色和蛋白印迹实验鉴定PaSCs特征性标记物(aSMA, Desmin, Vimentin, GFAP), ECM (collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin和laminin)以及相关的生长因子(CTGF和TGFβ1)。结果：(1)电镜和相差显微镜下观察,PaSCs呈典型的条索状或纺锤状,细胞核位居中间,细胞有细长伪足。(2)电镜和免疫荧光结果证实PaSCs分布于胎儿胰腺的导管细胞或胰岛细胞团周围。(3)胎儿胰腺组织块培养72小时内有星状细胞自胰腺组织块外生出,细胞呈星形或不规则形,胞浆内遍布绕核周分布的脂滴样透明颗粒。随着培养时间延长,外生细胞不断迁移,细胞数量呈指数增加。(4)免疫荧光染色和蛋白印迹实验鉴定组织块外生法分离得到的PaSCs,传代后胞内脂质消失,表达星状细胞标记物(aSMA, Desmin, Vimentin, GFAP),并高表达ECM (collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin和laminin)以及相关的生长因子(CTGF和TGFβ1),但是不表达导管细胞表面标记物(CK19)和间充质细胞表面标记物(stromal cell surface marker)。结论：本课题首次证实PaSCs呈典型的条索状或纺锤状分布于胎儿胰腺的导管细胞或胰岛细胞团周围。有效分离、纯化胎儿PaSCs,细胞表达星状细胞标记物,合成ECM以及相关的生长因子。本实验原代细胞的分离方法提供了足够的细胞数量来分析整合素受体对PaSCs的功能及活性的影响,还为深入了解PaSCs在胰腺发育过程中对胰腺形态完整,血管新生,及内分泌分化的作用提供了机会。第二部分 αβ1整合素在胎儿胰腺星状细胞的表达和功能目的：分析整合素受体在胎儿PaSCs的表达情况。观察α3β1整合素受体与相关配体相互作用对PaSCs粘附和迁移力的影响。探寻α3β1整合素受体与collagen Ⅰ相互作用对细胞生长因子的合成和增殖能力的影响及其相关的信号通路。方法：(1)免疫荧光染色和蛋白印迹实验检测β1和β3整合素受体及其相关的α亚基,包括α1,α2,α3,α5,α6,αv在人类胎儿PaSCs中的表达情况。(2)通过细胞粘附实验和创伤划痕实验观察PaSCs培养在collagen Ⅰ, collagen Ⅳ, fibronectin, laminin或BSA对照组上,细胞粘附力和迁移力的影响。(3) PaSCs在collagen Ⅰ或BSA对照组预处理的24孔板上培养24小时,通过Ki67免疫荧光染色检测细胞的增殖能力,蛋白印迹实验检测PaSCs合成生长因子(TGFβ1和CTGF)的能力。(4)蛋白印迹实验检测α3和β1整合素受体的表达及下游信号分子(FAK, ERK, AKT, cyclinD1)的活性。结果：(1)免疫荧光染色和蛋白印迹实验证实PaSCs表达β1整合素受体及其相关的α1-3,α5-6和αv亚基,其中,α3,α5和β1整合素受体高表达,而β3表达水平相对较低。(2)细胞粘附实验和创伤划痕实验结果表明,与对照组相比,PaSCs在collagen Ⅰ和collagen Ⅳ上培养表现出强粘附性[(3.568±0.5677)&(2.957±0.5541)vs.(1.000±0.03604),p<0.01-0.001]和强迁移力。(3)PaSCs在collagen Ⅰ上培养24小时,细胞增殖[(12.44±3.028)vs.(6.303±1.702),p<0.05]与合成TGFβ1 [(3.114±0.4693) vs. (1.000±0.1583),p<0.01], CTGF [(1.509±0.3355) vs. (1.000±0.2980), p<0.05]的能力较对照组明显增强。(4) PaSCs在collagen Ⅰ上培养24小时,α3整合素[(1.336±0.2262)vs.(1.000±0.2627),p<0.05]和β1整合素[(2.078±0.06824)vs.(1.000±0.3220),p<0.01]蛋白表达水平高于对照组。(5) PaSCs在collagen Ⅰ上培养24小时,FAK[(2.026±0.3769) vs. (1.000±0.08664), p<0.05], ERK [(1.542±0.6009) vs. (1.000 ±0.6367), p<0.01], AKT [(3.026±0.6649) vs. (1.000±0.3501), p<0.01]的磷酸化和cyclinD1的蛋白表达水平[(1.186±0.2012)vs.(1.000±0.1933),p<0.001]明显高于对照组。结论：PaSCs高表达α3β1整合素受体。Collagen Ⅰ激活α3β1整合素受体,相互作用促进细胞的粘附,迁移,增殖和生长因子的合成,同时激活FAK/ERK和PI3K/AKT信号通路。第三部分中和抗体阻断β1整合素受体对胰腺星状细胞功能和增殖的影响目的：采用β1整合素中和抗体阻断其活性,进一步明确β1整合素受体与collagen I相互作用对胎儿PaSCs活性和增殖的影响及其相关的分子机制。方法：(1)分别用抗人β1整合素抗体,人IgG2a同种型阴性对照,或新鲜的无血清培养基预处理PaSCs1小时。(2)通过细胞粘附实验和创伤划痕实验观察不同预处理的PaSCs培养在collagen Ⅰ上,细胞粘附力和迁移力的改变。(3)不同预处理的PaSCs在collagen Ⅰ培养24小时后,通过Ki67免疫荧光染色检测细胞的增殖能力,蛋白印迹实验检测PaSCs合成生长因子(TGFβ1和CTGF)的能力。(4)蛋白印迹实验检测相关下游信号分子(FAK,ERK,AKT, cyclinD1)的活性。结果：(1)细胞粘附实验和创伤划痕实验结果表明,抗人β1整合素抗体预处理的PaSCs在collagen Ⅰ上的粘附力[(0.4750±0.02372)vs.(1.000±0.06726)&(0.9275±0.05621),p<0.01-0.001]和迁移力显著低于对照组,IgG2a预处理的PaSCs与空白对照组预处理的细胞相比无明显变化[(0.9275±0.05621)vs.(1.000±0.06726),p>0.05]。(2)功能性阻断p1整合素受体,PaSCs的细胞增殖能力[(4.913±0.4373) vs.(11.76±1.127)&(9.957±1.041), p<0.05-0.01],TGFβ1[(0.3932±0.06421) vs.(1.000±0.1464)&(0.9505±0.2482), p<0.05]和CTGF的合成[(0.5914±0.1294) vs.(1.000±0.08527)&(1.154± 0.1290),p<0.05=0.01]明显低于空白对照组和IgG2a预处理组。(3)蛋白印迹实验结果显示阻断β1整合素受体,下游FAK[(0.2320±0.03216)vs.(1.000± 0.2324)&(0.9152±0.1274),p<0.05],ERK[(0.3765±0.05115)vs.(1.000±0.1118) &(1.142±0.1313),p<0.05-0.01]的磷酸化和cyclinD1的蛋白表达水平[(0.6149±0.09029)vs.(1.000±0.08192)&(0.9749±0.04767),p<0.05-0.01]明显低于对照组,但对AKT的磷酸化水平无影响[(1.218±0.1099)vs.(1.000±1.229)&(1.239±0.1276),p>0.05]。结论：阻断β1整合素受体显著降低PaSCs的粘附和迁移力,抑制细胞增殖与生长因子的合成,伴随FAK/ERK/cyclinD1信号通路的下调。