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背景糖尿病性骨质疏松症(Diabetic Osteoporosis, DOP)是糖尿病在骨关节系统的一种严重慢性并发症,表现为骨量减少,骨组织显微结构受损,骨脆性增加,易发生骨折,是继发性骨质疏松的一种。随着生活水平的提高和人口老龄化的不断加剧,糖尿病患者骨质疏松发病率逐年上升,可达20%～72%,严重危害着患者的健康。骨具有良好的再生能力与可塑性,均来源于骨吸收与骨形成过程复杂有序的交替进行。在正常生理条件下,骨改建处于动态平衡状态;而在病理条件下,如糖尿病性骨质疏松的骨改建模式则打破了骨吸收和骨形成的平衡,骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromall cells, BMSCs)的功能改变与功能障碍是这种病态式骨改建的根本原因。microRNA是近年来新发现的一类在多种真核生物中调控基因表达的小的非编码RNA,能够通过与信使RNA的碱基配对来调节靶基因的表达。microRNA参与了多细胞生物的生理和病理过程,调节着各种各样的生物反应,其中,microRNA对干细胞的状态和功能发挥着重要的调控作用。因此,想要更好的利用干细胞的特性来预防或治疗疾病,必须要了解microRNA对干细胞生物学功能的调控机制。目前,在糖尿病性骨质疏松中,microRNA作用于BMSCs成骨的具体机制及靶基因的调控途径尚不清楚。目的我们通过建立糖尿病性骨质疏松的大鼠模型,并从中分离培养出BMSCs,探讨其生物学特性的改变;通过microRNA高通量测序的方法筛选两种来源的BMSCs差异性表达的microRNA;通过生物信息学分析预测及验证microRNA对靶基因的调控作用,并明确其在BMSCs成骨分化过程中所起的作用,从而探讨特定microRNA在糖尿病性骨质疏松发病中可能的分子机制。方法(1)比较糖尿病骨质疏松大鼠来源的骨髓间充质干细胞(diabetes-BMSCs)和健康大鼠来源的骨髓间充质干细胞.(wistar-BMSCs)的生物学特性。使用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,通过血清生化检测、microCT检测、骨组织形态学分析的方法评价其骨质疏松情况;使用全骨髓贴壁法分离培养diabetes-BMSCs和wistar-BMSCs,运用流式细胞术表面分子鉴定、MTT实验、克隆形成实验、成骨分化诱导、成脂分化诱导实验,来比较两种BMSCs的生物学特性。(2)筛选diabetes-BMSCs和wistar-BMSCs差异表达的：nicroRNAo对diabetes-BMSCs和wistar-BMSCs进行microRNA高通量测序,利用qRT-PCR法验证测序结果,挑选出差异表达的microRNA。利用qRT-PCR法检测成骨成脂分化过程中及不同组织中差异microRNA表达情况。(3)分析miR-182对BMSCs增殖分化能力及成骨分化能力的影响。利用细胞转染技术调节miR-182在BMSCs中的表达水平,并通过MTT实验、成骨分化诱导、茜素红染色等,检测过表达或抑制miR-182时BMSCs增殖分化及成骨分化能力的变化。(4)分析miR-182在BMSCs成骨分化过程中的调控机制。使用生物信息学检测的方法预测miR-182的候选靶基因Smad1,通过构建双荧光素酶报告基因载体对靶基因进行验证。利用qRT-PCR及Western blot检测miR-182过表达时,靶基因Smadl及相关成骨基因Runx2在BMSCs成骨分化过程中的内源性表达。结果(1)STZ腹腔注射诱导的糖尿病大鼠造模8周后,与正常组相比,体重、血清中骨钙素含量、肱骨及腰椎骨密度、骨组织体积比明显降低,骨小梁间隙增大。两种来源的BMSCs均高表达CD44. CD90. CD 105,不表达CD34, CD45。diabetes-BMSCs增殖分化能力显著低于wistar-BMSCs,两者均具有克隆形成能力。diabetes-BMSCs的成骨分化能力明显低于wistar-BMSCs,而diabetes-BMSCs的成脂分化能力明显高于wistar-BMSCs。(2) diabetes-BMSCs和wistar-BMSCs通过micro RN A高通量测序筛选出10条差异表达的microRNA,其中miR-182在diabetes-BMSCs及糖尿病骨质疏松大鼠骨组织中表达显著升高。在diabetes-BMSCs和wistar-BMSCs成骨分化过程中均可观察到miR-182表达下降,在成脂分化过程中均可观察到miR-182表达上升,因此我们选择miR-182进行后续研究。(3)miR-182对BMSCs的增殖能力无明显影响。过表达miR-182时,BMSCs的成骨分化能力可显著降低,而抑制miR-182时,BMSCs的成骨分化能力可略提高,但无显著性差异。(4)生物信息学预测Smadl为miR-182的候选靶基因,双荧光素酶实验也验证了miR-182可以特异性与Smadl mRNA 3’-非翻译区结合。上调miR-182表达后引起Smadl表达下调,同时Runx2的表达也下调;而下调miR-182可引起Smadl表达水平上调。上调miR-182在BMSCs中的表达,能在成骨分化过程中抑制Smadl及成骨分化关键基因Runx2的表达,降低BMSCs的成骨分化能力。结论(1)糖尿病所导致的骨质疏松中,BMSCs仍具有干细胞基本的能力与特性,但是增殖分化能力降低,成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强。(2)糖尿病所致的骨质疏松中,BMSCs的miR-182表达特异性上升。(3)miR-182负向调控靶基因Smadl的表达,并通过降低Smadl及Runx2的表达从而影响BMSCs的成骨分化过程。