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精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是动物体内重要的成体干细胞,能够将遗传物质传递给下一代,它既有胚胎干细胞的发育特性又能发育成单倍体生殖细胞。现今有大量研究表明精原干细胞可在体外被诱导为具有不同功能的细胞系,用于遗传修饰、疾病治疗和转基因动物制备等,因此对精原干细胞体外操作的研究尤为重要。其中将SSCs诱导形成精子一直是科学家们研究的热门话题,但如何大量获得SSCs并使其产生具有功能性的精子就成为科学家们亟需解决的科学问题。通过本课题组前期已完成的鸡雄性ESCs,雄性PGCs以及SSCs的转录组测序(RNA-Seq)的实验结果,分析得到了鸡雄性生殖细胞发生过程中基因动态表达的水平变化,有助于对该过程中重要作用的未知基因的发现。本实验研究的目的基因CPED1在SSCs的转录组测序中特异高表达并功能未知,因此有可能对SSCs分化具有重要作用,因此本实验同时利用基因过表达技术和CRISPR/Cas9技术实现对测序过程中发现的精原干细胞高表达基因CPED1功能的研究,为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。本研究的主要内容如下：(1)基于本实验室前期RNA-Seq技术发现CPED1在ESCs向SSCs分化过程中存在显著差异表达。通过qPCR克隆如皋黄鸡CPED1编码序列,同时构建过表达载体pcDNA3.0-CPED1和敲除载体Cas9/gRNA。通过Fugene转染Cas9/gRNA载体,利用T7E1酶切、SSA活性检测、TA克隆测序和脱靶效率检测Cas9/gRNA载体敲除活性及脱靶情况。在DF-1细胞中通过T7E1酶切检测Cas9/gRNA载体的活性,酶切结果表明,通过条带灰度值估计Cas9/gRNA1载体、Cas9/gRNA2载体和Cas9/gR/A3载体活性分别为377、20%和30%%,Ca9/gR/A1载体敲除活性最佳;SSA活性检测结果表明gRNA1的荧光活性值与对照组相比增加了 2倍左右,活性最佳;TA克隆测序结果表明测序的8菌液样中有2管菌液样发生了突变,初步估计基因敲除率为25%左右;脱靶效率检测结果表明在DF-1细胞中无脱靶现象。同时实现了在ESCs中CPED1的定点敲除,敲除效率为25%。这一结果表明CRISPR/Cas9技术能稳定的在鸡DF-1细胞和ESCs上实现CPED1敲除。(2)分别将Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体通过Fugene转染ESCs,转染48小时候换RA诱导培养基培养12d。采用细胞形态学观察、间接免疫荧光检测、流式细胞分析和qRT-PCR等方法检测CPED1于敲除与过表达对ESCs向SSCs分化的影响,结果表明敲除CPED1的ESCs与正常RA诱导组相比,类胚体形成时间延长且停止向雄性生殖细胞分化;第12dRA诱导组与过表达组均能形成类SSCs,敲除组则无类SSCs形成。间接免疫荧光检测结果表明敲除CPED1导致体外诱导10d的ESCs分化生成的integrin α6和integrin β1双阳性类SSCs数量显著低于过表达组和RA诱导组。流式细胞分析结果表明RA诱导组、过表达组和敲除组中integrin α6阳性类SSCs数量比例分别为1.5%±0.163、1.8%%±0.294和0.9%±0.216,敲除组中阳性细胞率明显低于其它两组。12d qRT-PCR结果表明RA诱导组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrin α6和integrin β1的最高表达量分别为 1.72,1.62,1.74,2.01,2.36,2.42;过表达组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Strt8、integrinα6和integrin β1的最高表达量分别为2.68,1.71,1.95,2.46,2.67,2.78;敲除组中目的基因CPED1和生殖相关基因Cvh、C-kit、Stra8、integrin α6和integrin β1的最高表达量分别为 0.42,1.12,1.03,0.87,1.41,1.53;RA诱导组和过表达组中CPED1的表达量具有显著差异,敲除组中CPED1以及生殖相关基因Cvh、C-kit、、Stra8、integrin α6和integrin β1的表达量与RA诱导组和过表达组相比呈显著下调。在RA诱导ESCs向SSCs分化过程中,敲除CPED1抑制类SSCs形成,证明CPED1在调控家禽ESCs向SSCs分化过程中起重要作用。(3)取新鲜的受精鸡胚,利用PEI包裹Cas9/gRNA1载体和pcDNA3.0-CPED1过表达载体分别进行鸡胚注射,并设立正常孵化组与对照组。分别收集正常孵化至4.5d鸡胚生殖嵴样和18.5d睾丸样,采用石蜡切片及PAS染色、qRT-PCR和流式细胞分析等方法检测CPED1敲除和过表达对鸡雄性生殖细胞体内动态变化的影响。qRT-PCR检测结果显示4.5d的过表达组中生殖相关基因Cvh、Stra8和integrin α6的表达量分别为2.12,1.37,1.20,显著高于敲除组,CPED1表达量(1.07)极显著高于敲除组;18d的过表达组中的Nanog的表达量(0.32)显著低于对照组,integrin α6基因表达量(1.89)显著高于敲除组,CPED1表达量(2.09)极显著高于敲除组。4.5d鸡胚石蜡切片结果表明对照组中PGCs数量为(45±2.236)个,过表达组中PGCs数量为(41±1.699)个,敲除组中PGCs数量为(18±0.745)个,敲除组中含有的PGCs数量低于对照组和过表达组。同时对18d睾丸分离培养的SSCs进行流式细胞分析检测,结果表明对照组、过表达组和敲除组中integrin α6阳性细胞率分别为1.3%±0.141、1.6%±0.356和0.8%±0.245,敲除组中SSCs数量显著减少,对照组和过表达组中却无显著差异。结果证明CPED1对鸡胚干细胞向精原干细胞分化具有促进作用。