微生物法生产α-氨基丁酰胺的研究

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α-氨基丁酰胺是抗癫痫药物左乙拉西坦的关键中间体,生物转化法制备α-氨基丁酰胺对于制药绿色化具有重要意义。本研究的目的是探索利用腈水合酶催化α-氨基丁腈生产α-氨基丁酰胺的生物转化工艺。研究内容涉及产物α-氨基丁酰胺检测方法建立、产腈水合酶微生物筛选、产酶条件优化以及生物转化条件优化等。首先,建立α-氨基丁酰胺与α-氨基丁腈的薄层色谱分离方法,展开剂为:80%甲醇,显色剂0.2%茚三酮;以2,4-二硝基氟苯(DNFB)作为柱前衍生化试剂,建立α-氨基丁酰胺的高效液相色谱(HPLC)定量检测方法,衍生化条件是:衍生化试剂为0.7 mL的89.23 mM的DNFB,衍生化温度为70℃,衍生化时间为50 min。用上述检测方法从实验室保存的产腈水合酶菌株中,筛选出一株腈水合酶活力较高的小球诺卡氏菌(Nocardia globerula),其活力可达0.681 U/mg。其次,对N.globerula的产酶条件进行优化,考察了碳源、氮源和诱导剂种类及浓度,培养基初始pH,装液量和接种量,对产酶的影响。最终确定产酶培养基的配方为葡萄糖12 g/L、蛋白胨6 g/L、己内酰胺2 g/L、KH2PO4 1 g/L、K2HPO4?3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、NaCl 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L,pH 7.0),装液量为45 mL/250mL,接种量为3%。腈水合酶活力为0.914 U/mg,较优化前提高48.9%。最后,优化N.globerula的生物转化体系,考察因素包括反应温度、体系pH、底物添加量、菌体添加量、反应时间、底物和菌体流加等。确定催化反应的最适温度30℃,体系最佳pH 7.0,在10 mL的磷酸缓冲液反应体系中加入12 g/L的菌体和100 mM的α-氨基丁腈反应16 min后α-氨基丁酰胺含量能达到96.98 mM,通过底物流加和菌体流加至500 mM和13.2 g/L,最终获得183.45 mM的α-氨基丁酰胺。
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