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流行性感冒,是由流感病毒感染而引起的一种急性呼吸道传染病。中医认为流感属外感温病范畴,正气不足是患者感受外邪而致病的重要内因,在流感的发病过程中,外来邪毒耗伤正气,亦会导致机体正气衰竭。在流感的治疗过程中,初期风热犯卫证或热毒袭肺证,治宜疏风清热解毒,如临床治疗流感的常用方麻杏石甘汤,具有清热解毒、宣肺透邪的功效。同时,在外感性疾病的治疗中,应注重祛邪与扶正兼顾,顾护脾胃,扶助正气。临床流感感染可表现为多种证型,其中部分病例可见脾胃不和及肺脾气虚,小鼠感染流感后,出现乏力、气喘、纳差、便秘或腹泻、体重降低等肺脾气虚的表现,宜辅以健脾益气方,使正气充沛,脾胃调和,肺体得养。四君子汤是健脾益气代表方,临床常用于治疗多种疾病出现的肺脾气虚症状。因此,基于中医对外感热病的治疗思路,结合小鼠流感感染后出现肺脾气虚症状的表现,本课题拟在小鼠流感感染模型上,观察清热宣肺方麻杏石甘汤、健脾益气方四君子汤及两方合用对小鼠流感感染治疗的疗效,以探讨健脾益气方对清热宣肺方治疗小鼠流感是否具有增效作用,并进一步探讨其机制。TLR与炎性小体通路在机体抗流感免疫应答中发挥着重要作用。此外,流感病情的发展与预后与Th1/Th2细胞因子失衡相关。麻杏石甘汤合用四君子汤是否通过调节TLR、炎性小体通路以及Th1/Th2平衡从而调控抗流感病毒免疫应答,需进一步研究。目的:本课题针对以上三个问题进行研究,建立小鼠流感病毒感染模型,观察麻杏石甘汤、四君子汤,以及麻杏石甘汤合四君子汤(以下简称麻四汤)对小鼠流感的治疗效果,以明确四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感是否具有增效作用;检测各组药物对小鼠肺组织中TLR7、MyD88、NF-κB,ASC、Caspase-1、NLRP3,及肺组织匀浆中 IL-1β、IL-18 的影响,以明确麻杏石甘汤、四君子汤及麻四汤对抗流感病毒固有免疫应答中TLR、炎性小体通路的影响;检测TNF-α、IFN-y为代表的Th1型细胞因子,IL-4、IL-10为代表的Th2型细胞因子,以明确麻杏石甘汤、四君子汤及麻四汤对流感感染小鼠肺组织Th1/Th2平衡的影响。我们的研究基于中医治疗外感热病的思路,为健脾益气类中药协同清热解毒宣肺类中药在临床流感治疗中的应用提供实验依据及基础。方法:1.四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感病毒感染小鼠增效作用的研究建立小鼠致死量流感病毒感染模型并设立正常组、病毒组、四君子汤组(以下简称四君组)、麻杏石甘汤组(以下简称麻杏组),以及麻杏石甘汤合四君子汤组(以下简称麻四组),通过对小鼠体重、体温及一般情况、死亡率、延长生命率的观察、小鼠肺指数、HE染色法观察肺组织病变、荧光定量PCR检测各组小鼠肺组织病毒RNA水平,评价四君子汤、麻杏石甘汤、以及两者合方对小鼠流感的治疗效果。2.四君子汤、麻杏石甘汤、麻四汤对流感感染小鼠肺组织中TLR及炎性小体信号通路的影响建立小鼠亚致死量流感病毒感染模型并设立正常组、病毒组、四君组、麻杏组、麻四组,分别于感染后的第4、7d取小鼠肺组织,荧光定量PCR检测各组TLR信号通路中TLR、MyD88、NFkB mRNA表达,炎性小体信号通路中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达,Western blot检测NFkB、p-NFkB、Caspase-1蛋白表达,流式细胞技术检测肺组织中IL-1 β水平,ELISA检测小鼠肺组织中IL-18水平。3.四君子汤、麻杏石甘汤、麻四汤对流感感染小鼠肺组织中Th1/Th2细胞因子的影响建立小鼠亚致死量流感病毒感染模型并设立正常组、病毒组、四君组、麻杏组、麻四组,分别于感染后的第4、7d取小鼠肺组织,流式细胞术检测IFN-γ,TNF-α表达水平,IL-4、IL-10表达水平。结果:1.四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感病毒感染小鼠增效作用的研究1.1.小鼠感染致死量的流感病毒后,病毒组的死亡率达到100%;麻杏组死亡率为60%,四君组死亡率达到87%,与病毒组比较,四君组与麻杏组死亡率和平均存活天数与病毒组相比无显著性差异(p>0.05);麻四组死亡率20%,麻杏石甘汤合四君子汤能显著降低流感病毒小鼠死亡率,延长其平均存活天数(p<0.01)。1.2.用药后2～5天,麻杏组小鼠体温较病毒组升高(p<0.05),四君组小鼠一般情况及体重、体温较病毒组变化不明显(p>0.05),麻四组小鼠一般情况较病毒组明显好转(p<0.05),体重、体温较病毒组升高(p<0.05)。1.3.小鼠感染致死量的流感病毒5天后,与病毒组相比,麻杏组、四君组小鼠肺组织流感病毒RNA水平均有所降低,但结果并无显著差异(p>0.05),而麻四组小鼠肺组织流感病毒RNA水平则显著降低(p<0.01)。1.4.致死量流感病毒感染小鼠5天后,病毒组肺指数较正常组显著升高(p<0.001),麻杏组、四君组小鼠肺指数与病毒组相比均值有所降低,但差异并无统计学意义(p>0.05),麻四汤能显著减低小鼠肺指数(p<0.05)。1.5.HE染色检测肺组织病变,与正常组相比,病毒感染模型组小鼠肺组织间质性炎症,病变数量多,范围广,炎症细胞分布密度高;麻杏组与病毒组相比病变范围较局限、炎细胞密度较低,肺泡腔内浆液性渗出减少;四君组与病毒组相比病变范围局限、病变程度较轻;麻四组与病毒组相比病变程度、范围明显减轻,肺泡结构较完整病变明显减轻。2.四君子汤、麻杏石甘汤、麻四汤对流感感染小鼠肺组织中TLR及炎性小体信号通路的影响2.1.1.TLR通路中TLR7、MyD88、NFkB mRNA表达:流感感染后第4天,与正常组相比,TLR7、MyD88、NFkB 在病毒组中显著升高(p<0.001,p<0.01,p<0.001);与病毒组相比,TLR7 mRNA在麻杏组、四君组表达显著降低(p<0.05),而MyD88、NFkB mRNA表达水平则无显著性差异;与病毒组相比,TLR7、MyD88、NFkB mRNA表达水平在麻四组表达量显著降低(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。感染后第7天,病毒组TLR7、MyD88、NFkB mRNA表达较正常组明显降低(p<0.01);与病毒组相比,TLR7在四君组、麻四组中表达显著升高(p<0.05,p<0.01),MyD88、NFkB mRNA在病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异;与病毒组相比,TLR7、MyD88、NFkB mRNA在麻四组中表达显著升高(p<0.01,P<0.01,p<0.05)。2.1.2.Western blot检测各组p-NFκB/NFκB表达水平结果显示,在小鼠感染流感病毒后第4天,与正常组相比病毒组显著增高(p<0.05),麻杏组、四君组与病毒组相比均值有所降低,麻四组表达水平显著降(p<0.05)。感染后第7天,较之正常组病毒组表达有所降低而无统计学差异(p>0.05),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著性差异,而在麻四组中表达则显著升高(p<0.05)。2.2.1.荧光定量PCR检测炎性小体信号通路中ASC、NLRP3、Caspase-1表达:在小鼠感染流感病毒后第4天,与正常组相比病毒组ASC、NLRP3、Caspase-1表达水平显著增高(p<0.001,p<0.01,p<0.001),而麻四汤能显著降低其表达水平(p<0.01,p<0.05,p<0.01),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著差异。而在感染后第7天,较之正常组病毒组 ASC、NLRP3、Caspase-1 表达明显降低(p<0.01,p<0.01,p<0.001),而在麻四组中表达则显著升高(p<0.05),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著差异。2.2.2.Westernblot检测Caspase-1:在小鼠感染流感病毒后第4天,与正常组相比病毒组表达显著增高(p<0.05),麻四汤则使其表达显著降低(p<0.05),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著差异。感染后第7天,病毒组表达量显著低于正常组(p<0.05),而麻四组表达量显著增高(p<0.05),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著差异。2.3.1.荧光定量PCR检测IL-1β、IL-18 mRNA:感染后第4天,病毒组IL-1β、IL-18 mRNA水平明显高于正常组(p<0.01,p<0.01),与病毒组相比,麻四组IL-1β、IL-18显著降低(p<0.05,p<0.05),而麻杏组、四君组无显著差异;感染后第7天,病毒组IL-1β、IL-18表达显著低于正常组(p<0.05,p<0.001),麻四组IL-1β、IL-18显著高于病毒组(p<0.01,p<0.001),麻杏组、四君组与病毒组相比无显著性差异。2.3.2.流式细胞术检测IL-1β表达水平:第4天,病毒组IL-1β表达水平明显高于正常组(p<0.01),而麻四组能使其表达显著降低(p<0.05),病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异;第7天,病毒组表达显著降低(p<0.001),而麻四组表达显著升高(p<0.01),病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异。2.3.3.ELISA检测IL-18:在小鼠感染流感病毒后第4天,与正常组相比病毒组IL-18表达水平显著增高(p<0.001),麻杏组、四君组与病毒组相比没有显著差异,而麻四汤能显著降低其表达水平(p<0.01)。在感染后第7天,较之正常组病毒组表达明显降低(p<0.01),麻杏组与病毒组相比没有显著差异,而在四君组与麻四组中表达则显著升高(p<0.01,p<0.01,p<0.05)。3.四君子汤、麻杏石甘汤、麻四汤对流感感染小鼠肺组织中Th1/Th2细胞因子的影响3.1.流式细胞术检测IFN-γ、TNF-α的表达:感染后第4天,与正常组相比,IFN-γ、TNF-α在病毒组中显著升高(p<0.001),病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异,在麻四组表达量显著降低(p<0.05)。感染后第7天,病毒组IFN-γ、TNF-α表达较正常组明显降低(p<0.001),IFN-γ在麻杏组、四君组中表达显著升高(p<0.01,p<0.001)。TNF-α在病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异;IFN-γ、TNF-α在麻四组表达较病毒组显著升高(p<0.05)。3.2.流式细胞术检测IL-4、IL-10的表达:第4天,病毒组IL-4、IL-10表达水平明显低于正常组(p<0.01,p<0.001),与病毒相比,IL-4在麻杏组、四君组、麻四组中均显著增高(p<0.05,p<0.01),IL-10在病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异,而在麻四组中表达显著升高(p<0.01);第7天,IL-4、IL-10在病毒组表达显著低于正常组(p<0.001,p<0.01),病毒组与麻杏组、四君组相比无显著性差异,而在麻四组表达显著升高(p<0.001,p<0.05)。结论:1.在小鼠流感的治疗中,麻四组效果明显优于麻杏组,四君组则无明显的疗效,说明四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感具有明显的增效作用。2.四君子汤对麻杏石甘汤治疗流感增效作用机制可能为麻四汤能够在病毒感染早期阻断TLR、炎性小体通路,降低IL-1 β、IL-18的表达,从而减轻炎性反应;而在病毒感染的晚期能够增强TLR、炎性小体通路的活化,促进IL-1 β、IL-18的表达,从而促进抗病毒适应性免疫应答,抑制流感病毒的复制。3.麻杏石甘汤与四君子汤合用在小鼠流感的治疗中可以起到调节Th1/Th2细胞免疫平衡的作用,不仅可以保护机体免受过激的免疫应答造成的损伤,同时可以调节抗病毒免疫应答,促进病毒的清除。