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乳腺是哺乳动物特有的可泌乳的分泌型器官，乳腺上皮细胞是体外研究乳腺生理功能的重要模型，是体内泌乳系统细胞的典型代表。泌乳性状作为奶山羊重要的性状之一，研究乳汁主要成分乳蛋白和乳脂形成的分子机制可为奶山羊分子育种提供理论依据，加快育种进程。MiRNA是一类多靶点的非编码RNA，通过种子位点与靶基因结合，对靶基因进行转录后调控，继而参与多种生物进程。MiRNA在不同泌乳时期的差异表达显示miRNA在调节泌乳性状方面发挥重要作用。本课题组前期研究显示奶山羊乳腺中novel-miR-3880在奶山羊泌乳高峰期的表达量较高，有报道指出泌乳高峰期乳腺中代谢速率明显加快，底物摄取增加，蛋白和脂质合成增多，由此推测novel-miR-3880在乳腺发育和乳合成中发挥调节作用。环状RNA是一类可变剪切产生的共价闭环非编码RNA，有多个miRNA结合位点，可作为miRNA分子海绵与miRNA靶基因产生竞争性结合，从而减弱miRNA对靶基因的调节作用。然而，novel-miR-3880和环状RNA在奶山羊泌乳分子机制方面研究较少。本课题组前期通过高通量测序建立了奶山羊环状RNA数据库，通过生物信息学分析，预测可通过吸附性结合novel-miR-3880的环状RNA，为研究novel-miR-3880在乳腺中的作用机制奠定基础。
本研究通过透射电子显微镜观察novel-miR-3880对小鼠乳腺结构的影响，采用高通量测序初步筛选奶山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中novel-miR-3880下游差异基因，通过实时定量PCR技术、双荧光素酶报告试验和WesternBlot技术进一步验证筛选novel-miR-3880靶基因，并通过siRNA和过表达的方法探讨靶基因和环状RNA对GMEC的调控作用；通过ELISA、EdU、免疫组化等技术研究了环状RNA-miRNA-mRNA对乳腺泌乳性状的调控机理。本研究的主要结果如下：
1.山羊novel-miR-3880下游差异基因的筛选及其对乳腺发育的调控作用
本研究通过转录组测序筛选获得novel-miR-3880的67个下游差异基因，采用实时定量PCR的方法验证转录组测序结果的准确性，并对差异基因进行GO富集以及KEGG富集，分析发现novel-miR-3880下游差异基因参与到催乳素信号通路(Prolactin signaling)、RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling)、TNF信号通路(TNF signaling)和NF-κB信号通路(NF-κBsignaling)等与乳腺发育相关的信号通路中。在透射电子显微镜下，对照组小鼠乳腺已进入退化期，而novel-miR-3880处理的小鼠乳腺腺泡充盈，导管丰富，其雌性仔鼠平均体重也显著高于对照组，可知novel-miR-3880促进乳腺发育，且乳汁成分促进仔鼠生长，与对照组相比，novel-miR-3880使乳腺中甘油三酯含量升高，同时血液甘油三酯含量不发生变化。在GMEC中，novel-miR-3880促进甘油三酯合成和脂滴形成，并使κ-酪蛋白分泌增加，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌减少。
2.Novel-miR-3880对RIG-I样受体信号通路的调节
GMEC中转染novel-miR-3880后，检测RIG-I样受体信号通路中的关键基因ISG15和RIG-ImRNA和蛋白的表达量，发现mRNA和蛋白水平的表达量显著降低。通过序列比对发现ISG15序列中含novel-miR-3880的结合位点，荧光素酶检测结果表明novel-miR-3880不能通过与ISG15结合位点的结合调节ISG15的表达，且siRIG-I促进ISG15的表达，siISG15促进RIG-I的表达，此外对novel-miR-3880差异基因中干扰素相关基因的调节，siISG15起促进作用，siRIG-I起抑制作用，推测其与ISG15和RIG-I之间的调控有关。然而ISG15过表达时，对RIG-I的调节作用并不显著，在ISG15高表达的条件下，novel-miR-3880对RIG-I无显著性调节作用。GMEC凋亡检测结果显示novel-miR-3880、siISG15和siRIG-I抑制GMEC凋亡。novel-miR-3880和siISG15可抑制促凋亡基因Caspase3、p53和TLR4的表达，促进抗凋亡基因Bcl-2的表达，ISG15过表达时促进Caspase3、p53和TLR4的表达，抑制Bcl-2的表达，而siRIG-I抑制Caspase3和p53的表达，促进Bcl-2的表达，同时促进TLR4的表达，siRIG-I对GMEC凋亡的调节也表现为抑制作用，推测siRIG-I引起的ISG15的表达量升高可能是TLR4被上调的原因之一。
3.CiRNA13761在GMEC中的作用
CiRNA13761来源于DOCK1的第36、37、38外显子，在山羊各组织中广泛表达，实时定量PCR结果表明ciRNA13761与DOCK1之间存在相互抑制关系。通过荧光素酶活性试验和实时定量PCR检测发现ciRNA13761可通过吸附性结合novel-miR-3880，降低novel-miR-3880在GMEC中的表达量。在GMEC细胞活力、细胞增殖检测中发现ciRNA13761抑制GMEC活力和增殖，此外，ciRNA13761可减少GMEC甘油三酯合成和脂滴形成，促进αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌，抑制κ-酪蛋白分泌，而novel-miR-3880过表达可抑制ciRNA13761对GMEC活力、增殖、酪蛋白分泌、甘油三酯合成和脂滴形成的调节作用。
4.Novel-miR-3880靶基因鉴定及ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络构建
ELF2属于Ets转录因子家族，介导发育、分化、生长、转化等关键细胞过程。ELF2序列中有两处含novel-miR-3880种子位点，分别构建双荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶活性试验发现ELF2-1中的结合位点可被novel-miR-3880结合，与ciRNA13761的结合位点形成竞争。实时定量PCR和WesternBlot结果表明GMEC中存在ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络，其中novel-miR-3880与ciRNA13761相互抑制，novel-miR-3880抑制ELF2mRNA和蛋白的表达，ciRNA13761促进ELF2mRNA和蛋白的表达；ELF2抑制novel-miR-3880的表达，促进ciRNA13761和DOCK1的表达；novel-miR-3880促进DOCK1的表达，ciRNA13761抑制DOCK1的表达；siDOCK1促进novel-miR-3880和ciRNA13761的表达，但对ELF2的表达无显著调节。酪蛋白和甘油三酯含量检测以及油红O试验结果表明ELF2抑制GMEC甘油三酯合成和脂滴形成，抑制κ-酪蛋白分泌，促进αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌。
5.CiRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络对GMEC调控机理的研究
MTOR与启动泌乳所需的PI3K/AKT形成功能性复合物，调节蛋白质脂质合成和细胞生长，mTOR的磷酸化是乳蛋白和乳脂合成关键基因S6K1激活的重要途径。WesternBlot结果显示ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络和DOCK1参与调节GMEC中PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路的磷酸化水平，调节Bcl-2/Bax的表达。通过实时定量PCR检测发现PI3K、AKT、mTOR和S6K1对ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络有反馈调节作用，抑制PI3K、AKT、mTOR或S6K1使novel-miR-3880和DOCK1表达量升高，ciRNA13761和ELF2表达量降低。细胞增殖试验结果表明PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路在GMEC增殖调控中发挥关键作用，而ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2可通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路调节GMEC细胞增殖。
综上所述，novel-miR-3880可通过RIG-I通路调节GMEC凋亡，并参与ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络，通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1和Bcl-2/Bax通路调节GMEC细胞生长、乳脂合成和乳酪蛋白分泌，促进乳腺发育。
本研究通过透射电子显微镜观察novel-miR-3880对小鼠乳腺结构的影响，采用高通量测序初步筛选奶山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中novel-miR-3880下游差异基因，通过实时定量PCR技术、双荧光素酶报告试验和WesternBlot技术进一步验证筛选novel-miR-3880靶基因，并通过siRNA和过表达的方法探讨靶基因和环状RNA对GMEC的调控作用；通过ELISA、EdU、免疫组化等技术研究了环状RNA-miRNA-mRNA对乳腺泌乳性状的调控机理。本研究的主要结果如下：
1.山羊novel-miR-3880下游差异基因的筛选及其对乳腺发育的调控作用
本研究通过转录组测序筛选获得novel-miR-3880的67个下游差异基因，采用实时定量PCR的方法验证转录组测序结果的准确性，并对差异基因进行GO富集以及KEGG富集，分析发现novel-miR-3880下游差异基因参与到催乳素信号通路(Prolactin signaling)、RIG-I样受体信号通路(RIG-I-like receptor signaling)、TNF信号通路(TNF signaling)和NF-κB信号通路(NF-κBsignaling)等与乳腺发育相关的信号通路中。在透射电子显微镜下，对照组小鼠乳腺已进入退化期，而novel-miR-3880处理的小鼠乳腺腺泡充盈，导管丰富，其雌性仔鼠平均体重也显著高于对照组，可知novel-miR-3880促进乳腺发育，且乳汁成分促进仔鼠生长，与对照组相比，novel-miR-3880使乳腺中甘油三酯含量升高，同时血液甘油三酯含量不发生变化。在GMEC中，novel-miR-3880促进甘油三酯合成和脂滴形成，并使κ-酪蛋白分泌增加，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌减少。
2.Novel-miR-3880对RIG-I样受体信号通路的调节
GMEC中转染novel-miR-3880后，检测RIG-I样受体信号通路中的关键基因ISG15和RIG-ImRNA和蛋白的表达量，发现mRNA和蛋白水平的表达量显著降低。通过序列比对发现ISG15序列中含novel-miR-3880的结合位点，荧光素酶检测结果表明novel-miR-3880不能通过与ISG15结合位点的结合调节ISG15的表达，且siRIG-I促进ISG15的表达，siISG15促进RIG-I的表达，此外对novel-miR-3880差异基因中干扰素相关基因的调节，siISG15起促进作用，siRIG-I起抑制作用，推测其与ISG15和RIG-I之间的调控有关。然而ISG15过表达时，对RIG-I的调节作用并不显著，在ISG15高表达的条件下，novel-miR-3880对RIG-I无显著性调节作用。GMEC凋亡检测结果显示novel-miR-3880、siISG15和siRIG-I抑制GMEC凋亡。novel-miR-3880和siISG15可抑制促凋亡基因Caspase3、p53和TLR4的表达，促进抗凋亡基因Bcl-2的表达，ISG15过表达时促进Caspase3、p53和TLR4的表达，抑制Bcl-2的表达，而siRIG-I抑制Caspase3和p53的表达，促进Bcl-2的表达，同时促进TLR4的表达，siRIG-I对GMEC凋亡的调节也表现为抑制作用，推测siRIG-I引起的ISG15的表达量升高可能是TLR4被上调的原因之一。
3.CiRNA13761在GMEC中的作用
CiRNA13761来源于DOCK1的第36、37、38外显子，在山羊各组织中广泛表达，实时定量PCR结果表明ciRNA13761与DOCK1之间存在相互抑制关系。通过荧光素酶活性试验和实时定量PCR检测发现ciRNA13761可通过吸附性结合novel-miR-3880，降低novel-miR-3880在GMEC中的表达量。在GMEC细胞活力、细胞增殖检测中发现ciRNA13761抑制GMEC活力和增殖，此外，ciRNA13761可减少GMEC甘油三酯合成和脂滴形成，促进αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌，抑制κ-酪蛋白分泌，而novel-miR-3880过表达可抑制ciRNA13761对GMEC活力、增殖、酪蛋白分泌、甘油三酯合成和脂滴形成的调节作用。
4.Novel-miR-3880靶基因鉴定及ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络构建
ELF2属于Ets转录因子家族，介导发育、分化、生长、转化等关键细胞过程。ELF2序列中有两处含novel-miR-3880种子位点，分别构建双荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶活性试验发现ELF2-1中的结合位点可被novel-miR-3880结合，与ciRNA13761的结合位点形成竞争。实时定量PCR和WesternBlot结果表明GMEC中存在ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络，其中novel-miR-3880与ciRNA13761相互抑制，novel-miR-3880抑制ELF2mRNA和蛋白的表达，ciRNA13761促进ELF2mRNA和蛋白的表达；ELF2抑制novel-miR-3880的表达，促进ciRNA13761和DOCK1的表达；novel-miR-3880促进DOCK1的表达，ciRNA13761抑制DOCK1的表达；siDOCK1促进novel-miR-3880和ciRNA13761的表达，但对ELF2的表达无显著调节。酪蛋白和甘油三酯含量检测以及油红O试验结果表明ELF2抑制GMEC甘油三酯合成和脂滴形成，抑制κ-酪蛋白分泌，促进αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白分泌。
5.CiRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络对GMEC调控机理的研究
MTOR与启动泌乳所需的PI3K/AKT形成功能性复合物，调节蛋白质脂质合成和细胞生长，mTOR的磷酸化是乳蛋白和乳脂合成关键基因S6K1激活的重要途径。WesternBlot结果显示ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络和DOCK1参与调节GMEC中PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路的磷酸化水平，调节Bcl-2/Bax的表达。通过实时定量PCR检测发现PI3K、AKT、mTOR和S6K1对ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2网络有反馈调节作用，抑制PI3K、AKT、mTOR或S6K1使novel-miR-3880和DOCK1表达量升高，ciRNA13761和ELF2表达量降低。细胞增殖试验结果表明PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路在GMEC增殖调控中发挥关键作用，而ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2可通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1通路调节GMEC细胞增殖。
综上所述，novel-miR-3880可通过RIG-I通路调节GMEC凋亡，并参与ciRNA13761/novel-miR-3880/ELF2调节网络，通过PI3K/AKT/mTOR/S6K1和Bcl-2/Bax通路调节GMEC细胞生长、乳脂合成和乳酪蛋白分泌，促进乳腺发育。