研究背景:组织工程学为皮肤替代物的研究提供很好的方法,但目前遇到瓶颈难以解决。本研究围绕生物3D打印构建人工皮肤进行开展,研发一种可用于进行人工皮肤构建的生物型3D打印机,并进行体外的生物3D打印构建人工皮肤的初步探索。第一部分:生物型3D打印机研发与测试研究目的:研发一种可用于进行生物3D打印人工皮肤的生物型3D打印机,并对其进行稳定性测试。研究方法:为实现通过生物型3D打印机体外构建人工皮肤,课题组提出课题研究需要的生物型3D打印机设备的设计要求,并交由器械公司完成设备的制造。完成生物型3D打印机PrototypeSK00的制造后,通过3D Studio Max软件设计2种不同参数的三维模型(Cylinder001.stl和Cylinder002.stl)并通过RepetierHost软件解析成GOC文件,配置1%、2.5%和5%的海藻酸钠溶液,基于2种不同参数的模型和3种不同的打印成分测试5种不同内径的打印头(0.09mm,0.16mm,0.25mm,0.41mm和1.00mm)的运行情况。将成纤维细胞和表皮细胞消化形成细胞密度为1×10~8/ml DMEM悬液,将2种细胞经过不同内径的打印头的直接打印种植于12孔板中,检测经过打印操作后0h、6h、24h和48h的细胞存活率,对照组为直接通过微量移液枪将细胞种植于培养孔中。此外,为检测生物型3D打印机PrototypeSK00构建人工器官的稳定性,设计一个仿真鼻的三维模型并基于2.5%海藻酸钠和0.41mm打印头进行体外打印运行测试,对照为相同的三维模型在工业型3D打印机构建的聚乳酸人工鼻模型。研究结果:经课题组设计并完成制造生物型3D打印机-PrototypeSK00。运行检测过程发现基于0.09mm打印浓度较高的海藻酸钠溶液时,容易发生堵头现象。打印浓度较低海藻酸钠溶液时,总体积较大的模型在打印后期,容易发生水分蒸发导致前期构建的模型干燥坍塌而致使打印失败。成纤维细胞和表皮细胞经过打印操作后,0h-48h的细胞存活率最低95%,最高100%,与对照组无明显统计学差异。通过生物型3D打印机PrototypeSK00的仿真鼻能够与工业型3D打印机构建的人工鼻模型接近。研究结论:课题组研发了一种运行相对稳定的生物型3D打印机-PrototypeSK00,其运行过程无明显错误发生,经过其打印操作后细胞存活率与微量移液枪无差异,通过该打印能稳定运行体外构建高级人工结构。第二部分:应用于生物型3D打印机的皮肤“生物墨水”的研发与检测研究目的:研制一种能够在生物3D打印机使用的进行体外构建人工皮肤需要的作为支架成分的“生物墨水”。研究方法:将重组胶原蛋白与藻酸盐溶液混合灭菌形成“生物墨水”,对照品为不含胶原蛋白成分的藻酸盐溶液。将部分样品冻干形成固态进行扫描电镜检测观察材料的物理表征,并于流体旋转流变仪上进行样品的流体力学检测。以传代培养旺盛的成纤维细胞和表皮细胞为实验体系,检测“生物墨水”的细胞毒性。通过bal/bc裸鼠及SD大鼠的全层皮肤缺损模型检测该“生物墨水”修复创面的作用,第1、2、3、4周取病理,观察创面愈合情况、血管化情况、胶原残留情况及表皮爬行情况。研究结果:通过重组人胶原蛋白构建了一种孔隙均匀的具有高生物活性的胶原蛋白“生物墨水”,对表皮细胞及成纤维细胞无明显毒性。裸鼠的创面治疗实验证实了含有胶原蛋白的“生物墨水”能够有利于促进创面血管化、促进皮肤真皮层厚度恢复以及提高创面的胶原蛋白含量。研究结论:本部分的研究内容为通过应用重组人III型胶原蛋白作为本课题使用的“生物墨水”材料,构建一种与皮肤的细胞外基质相接近的“生物墨水”,检测其生物毒性与创面治疗作用,其本身具有加速创面愈合和改善创面愈合质量作用,为构建生物3D打印人工皮肤做准备。第三部分:基于生物型3D打印机的人工皮肤的初步构建与检测研究目的:基于自主研发生物型3D打印机PrototypeSK00和研制的胶原蛋白“生物墨水”,结合成纤维细胞和表皮细胞,进行通过生物3D打印的方式初步探索体外模拟构建生物3D打印人工皮肤的试验,并对其进行初步的生物学评价。研究方法:以计算机3D Studio Max程序(Autodesk公司,美国)作为模型建立软件,建立了模拟人皮肤真皮层和表皮层的多层次三维模型数据。将成纤维细胞与表皮细胞混合入“生物墨水”中,进行模拟人体皮肤结构的体外3D打印,并立刻进行冰冻切片的方式结合HE染色观察其显微结构。通过转染EGFP基因序列成纤维细胞中,并以嘌呤霉素进行筛选构建能稳定表达EGFP蛋白的成纤维细胞,以该细胞体系为种子细胞体外3D打印构建多层结构,并在荧光显微镜下观察体外培养7天后的细胞状态。研究结果:基于生物型3D打印机和“生物墨水”成果完成人工皮肤的体外生物3D打印构建,冰冻切片后的HE染色观察,能够明显区分“真皮层”和“表皮层”。体外培养7天后,具有稳定表达EGFP的成纤维细胞的通过3D打印构建的多层结构证明成纤维细胞在“生物墨水”中存活良好,并且底层的细胞呈贴壁增殖。研究结论:通过生物3D打印的方式,以胶原蛋白“生物墨水”为支架,成纤维细胞和表皮细胞为种子细胞,能够在体外模拟皮肤的结构仿生构建人工皮肤。