鸡爪皮胶原多肽制备及对酪氨酸酶活性抑制研究

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胶原多肽是目前研究比较广泛的一类多肽,采用酶法生产具有生物活性的胶原多肽,不仅有利于充分利用丰富的胶原蛋白资源,而且具有广泛的膳食和医药前景。胶原多肽因其安全性、功能多样性被人们逐渐认可;目前市场上已经出现许多具有降血压、抗氧化、营养调节等功能的多肽制品。本文以鸡爪皮为原料,采用响应面数学分析法优化了鸡爪皮胶原多肽的提取工艺,并对制备的胶原多肽初步分离纯化,对其酪氨酸酶活性抑制功能进行了研究。最后采用B16黑色素瘤细胞验证鸡爪皮胶原多肽的安全性及对黑色素合成影响的效果。论文首先对鸡爪皮胶原多肽的制备工艺进行了优化,以水解度(DH)为指标,从七种商业用酶中筛选出碱性蛋白酶作为实验用酶。然后进行单因素实验,以温度(T)、pH、底物浓度(S)、加酶量(E)、水解时间五个酶解因素进行优化;选取影响酶解显著的三个因素,以DH为响应值,采用响应面分析法进行三因素三水平实验,研究温度(T)、pH、底物浓度(S)对酶解过程的影响。结果表明:生产鸡爪皮胶原多肽的最优组合为温度61℃,pH8.10,底物浓度5.10%,加酶量2500U/g,酶解时间5h,水解度最大值为17.04±0.26%。使用超滤将最优酶解条件下制备的鸡爪皮胶原多肽进行分级,以酪氨酸酶抑制率为指标筛选出分子量小于3kd的多肽(组分III)为实验对象。对超滤的上样浓度和超滤进料口压力这两个因素进行优化,得到超滤最佳条件为:样品浓度1.5%,超滤压力200Kpa。将3kd的样品经大孔吸附树脂脱盐处理,以多肽回收率为指标优化上样浓度、乙醇流速和乙醇体积分数,得到最优结果为:上样浓度35mg·mL-1,乙醇流速90mL·h-1,乙醇体积分数70%,所得多肽回收率为96.70±0.76%。将脱盐后的组分III冷冻干燥后,测定其抑制酪氨酸酶活性,进行酪氨酸酶抑制动力学研究,测得鸡爪皮胶原多肽抑制酪氨酸单酚酶和酪氨酸二酚酶的IC50值分别为0.570mg·mL-1和0.426mg·mL-1。对酪氨酸二酚酶的抑制属于可逆非竞争性抑制,米氏常数Km和抑制常数分别为24.68μmol·mL-1和10.76mg·mL-1。以B16黑色素瘤细胞为模型,探索了鸡爪皮胶原多肽的安全性及对黑色素合成的影响。结果表明,鸡爪皮胶原多肽在0~200μg·mL-1的浓度范围内对细胞的增殖活性没有影响,而且能够有效的抑制黑色素的生成,200μg·mL-1胶原多肽浓度下,黑色素相对含量降低到57.83%。
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