基于动物细胞大规模培养技术生产的抗体类药物是当今治疗性生物技术产品的主流。近年来随着动物细胞培养技术的快速突破、药物安全性和功效性要求的不断提高,动物细胞大规模培养过程中表达的重组蛋白质量控制成为备受关注的关键问题。重组可溶性Ⅱ型肿瘤坏死因子受体(TNFR-Fc)对风湿性关节炎和类风湿性关节炎等疾病具有显著的疗效,拥有良好的市场前景。在我室前期已建立的高表达生产工艺中发现TNFR-Fc的生物学活性呈现高低不一的现象。然而培养过程、蛋白结构和其生物学活性的关系在已有研究中尚不明确,为建立经济、高效、质量可控的生物过程带来了极大的障碍。因此,深入理解TNFR-Fc抗体融合蛋白结构、功能和过程的关系,是保证产品质量可控,实现质量“设计”的前提,也是本文研究工作的核心。首先,通过疏水交换色谱发现了两种具有不同生物学活性的TNFR-Fc蛋白Peak A和Peak B,其中异构性蛋白(Peak B)的生物学活性仅为正常抗体融合蛋白(Peak A)的14%。使用半胱氨酸等还原剂对异构蛋白进行变性复性后,75%左右的Peak B蛋白转化为有活性的Peak A蛋白。随后采用基质辅助激光飞行质谱解析非还原条件下胰蛋白酶水解后的Peak A和Peak B蛋白多肽,显示分子量为1338、2004和3308 Da的肽段连接不同,从而确定Peak B的出现是由二硫键错配引起的。同时两种蛋白在分子量、电荷分布、糖型分布和一级结构等生化结构上极为相似。说明二硫键错配所产生的异构蛋白Peak B是造成抗体融合蛋白生物学活性降低的主要原因。其次,采用无细胞实验判定了异构蛋白二硫键错配过程发生于胞内蛋白质的合成阶段,异构蛋白的含量随着培养时间的延长而不断增加,培养后期的Peak B蛋白含量是前期的1.3倍。胞内蛋白质二硫键的合成涉及氧化还原条件、能量供应、酶催化等多个环节。因此,从细胞层次动态地分析CHO细胞典型流加培养过程中上述三个环节变化与异构蛋白Peak B形成的关系,发现培养后期的G1期细胞比例减少了 15～17%,胞内ATP含量降低了 50～63%,GSSG/GSH比例降低了 30%左右,说明高比例的G1期细胞组成、充足的能量供应以及强的胞内氧化环境能保证TNFR-Fc二硫键的正确形成,为后续培养过程参数优化,降低错配蛋白含量提供了科学指导。最后,在反应器中考察了溶氧、pH和两阶段培养转换时间等培养参数对TNFR-Fc异构蛋白表达的影响,其中溶氧对异构蛋白表达的影响最为显著,提高培养体系中的溶氧水平至70%,最终培养过程的异构蛋白含量比10%溶氧水平降低了 25%。同时在两阶段培养过程中,相同氧浓度下,pH控制6.8比7.2时的异构蛋白减少了 4～6%,第3天开始第二阶段培养比第5天减少了 2.1～3.3%,为在大规模中控制Peak B蛋白生成提供有利指导。基于以上培养参数对细胞状态的调节规律,在培养过程中优化了与细胞周期和胞内氧化环境紧密相关的培养基组分。在培养基中添加3 mmol/L的丁酸钠和3%浓度的二甲亚砜(DMSO)能有效地抑制细胞生长,使更多细胞停留在G1期,最终Peak B含量分别减少了 6.4%和8.7%,有效地调控了 TNFR-Fc二硫键的正确形成。通过本文的工作,揭示了培养过程中抗体融合蛋白生物学活性下降的原因,加深了蛋白生物学活性、结构及培养过程之间联系的理解,为提高已建立的流加培养过程中TNFR-Fc抗体融合蛋白生物学活性提供了科学地指导,也为其他抗体蛋白药物在质量设计指导下建立高产、优质且质量可控的培养工艺提出了新的思路。