由于缺乏合适的替代材料,泌尿道重建一直是临床上寻找解决的棘手问题。尿道狭窄多由外伤、炎症、尿道下裂及肿瘤等原因引起,以往多采用膀胱黏膜、包皮皮瓣、口腔黏膜等自体组织进行修复,但由于存在供区损伤,材源有限,易导致感染、尿瘘、尿道再狭窄等并发症,研究者尝试利用组织工程上皮复合材料进行重建。但上皮细胞存在体外培养、扩增易老化,无法达到复合回植所需细胞量,限制了其在临床上的应用。脂肪干细胞具有自我更新及定向分化潜能,且材源丰富,取材创伤小,为组织工程尿道重建研究的种子细胞选择提供了一种新的思路及可能。本实验尝试体外诱导兔模型脂肪干细胞向上皮细胞方向分化,经BrdU标记后与膀胱脱细胞基质复合,并探讨其应用于组织工程尿道重建的可行性,为脂肪干细胞今后在尿道重建研究中的运用提供实验依据。　　第一章脂肪干细胞(ASCs)的体外培养　　1、目的：探讨兔脂肪干细胞的分离,体外培养、扩增及鉴定方法。　　2、材料和方法：应用I型胶原酶消化法分离培养兔脂肪干细胞,获得脂肪干细胞后运用Hoechst33258染色法分析细胞生长增殖特性。利用免疫荧光对脂肪干细胞表面蛋白进行鉴定。用流式细胞仪检测细胞表面标志(CD13,CD29,CD31,CD44,CD45,CD49d,CD90,CD105)。　　3、结果：原代培养3 d后可见ADSCs贴壁生长,约7-9天左右可传代培养。镜下观察ADSCs贴壁后绝大多数为类成纤维细胞样长梭形形态,少数有突起,细胞相互之间以细丝拉网。培养细胞Hoechst33258染色法显示细胞指数增长期为5-7天,随后进入平台期。免疫荧光检测示α-SMA阳性,Vimentin,cytokeratin19,及HLA-DR均为阴性。流式细胞仪检测结果CD13、CD90、CD44、CD105、CD29表达阳性,CD49d表达弱阳性,CD31、CD45表达阴性。　　4、结论：利用I型胶原酶消化法可获得纯度较高的脂肪干细胞,材源广泛,取材简单,创伤小。体外培养条件下细胞能保持稳定的群体倍数增长,且细胞衰老率达到最低。脂肪干细胞形态与成纤维细胞形态相似,且缺乏特异性的标记蛋白。当前研究中,我们根据以往经验,采用流式细胞技术对脂肪干细胞的表面标记分子进行检测,并结合形态学特性,及增殖特性进行鉴定,判断为兔来源脂肪干细胞,以用于组织工程尿道重建的研究。　　第二章脂肪干细胞体外向上皮方向分化的研究　　1、目的：探讨兔脂肪干细胞在体外诱导条件下向上皮细胞分化的可能性。　　2、材料和方法：通过体外以包括ATRA,EGF,HGF,KGF,及hydrocortisone诱导剂结合液气平培养模式(air-liquid interface culture,ALI culture)建立3D诱导体系,通过不同条件设立诱导组及对照组,进行体外ADSCs向上皮方向诱导。诱导12天后,通过免疫荧光检测、Western blot检测、流式细胞检测、Real-time PCR检测评价诱导结果,并通过透射电镜检测,及Hoechst33258染色法评价诱导后细胞形态及增殖活性。　　3、结果：经过12天诱导,在最佳条件诱导组(2.5μMATRA,20 ng/ml EGF,10 ng/mlKGF,10 ng/ml HGF,and0.5μg/ml hydrocortisone in ALI culture),细胞出现类上皮样复层细胞形态,并通过蛋白水平及基因水平检测显示上皮早期分化标记cytokeratin19表达阳性,粘膜上皮分化标记cytokeratin13表达弱阳性,间充质细胞标记anti-α-SMA表达下降,但上皮终末分化标记involucrin表达阴性。　　4、结论：实验证明,ASCs在合适体外诱导环境下,能够向上皮细胞方向分化,出现相应形态学上改变及上皮分化蛋白的表达。对于当前在尿道组织工程研究中,上皮细胞存在的体外扩增困难,易老化的缺陷,提供了一种可行的解决方法;并为本实验进一步的开展,将上皮分化ASCs应用于尿道重建的研究提供了实验依据。　　第三章脂肪千细胞的体外BrdU标记　　1、目的：尝试BrdU体外标记脂肪干细胞,以示踪回植术后植入细胞在体内环境下的分化与转归。　　2、材料和方法：诱导后,及未诱导脂肪干细胞,在基础培养液中培养至细胞达70％融合,以15umol/L5-bromo-2-deoxyuridine(BrdU)的基础培养液继续培养48小时。培养后细胞分别以免疫荧光检测、Hoechst33258染色法评价BrdU标记效果,及标记后细胞增殖活性改变情况。　　3、结果：经过48小时体外孵化标记,免疫荧光检测显示诱导后,及未诱导脂肪干细胞细胞核均呈现BrdU标记阳性表达。同时,Hoechst33258染色法显示,在BrdU标记前后,脂肪干细胞增殖活性无明显改变。　　4、结论：实验证明非放射性标记物质BrdU能够在离体环境下对诱导后,及未诱导脂肪干细胞进行标记,并对细胞增殖活性无明显影响,能够作为评价植入细胞在体内分化与转归的标记物质,对本实验体内部分的进一步开展提供了可能。　　第四章上皮分化脂肪干细胞复合BAMG重建组织工程尿道的研究　　1、目的：探讨脂肪干细胞能否作为尿路上皮细胞的替代种子细胞,应用于兔模型组织工程尿道重建的研究。　　2、方法：通过制备的BAMG做为支架材料,与上皮方向分化后、及未分化脂肪干细胞复合,并分组进行兔模型的前尿道补片式替代重建手术(BAMG group:单纯的BAMG回植重建;Und-rASCs/BAMG group:BAMG复合未诱导脂肪干细胞回植重建;Epith-rASCs/BAMG group:BAMG复合上皮方向分化后脂肪干细胞回植重建),每组分别术后2周、1月、2月、6月行尿道造影,并处死后取替代段组织行包括大体标本观测,及免疫荧光等相关检测。　　3、结果：兔模型尿道重建术后,尿道造影显示BAMG group,Und-rASCs/BAMGgroup术后均出现不同程度狭窄(BAMG group术后2周出现1例尿瘘);Epith-rASCs/BAMG group术后2周出现轻度尿道狭窄,术后2月、6月造影对比术后2周尿道狭窄明显缓解。大体标本观测显示BAMG group,Und-rASCs/BAMGgroup组替代段局部疤痕挛缩明显;Epith-rASCs/BAMG group术后2周、1月替代段局部有一定程度挛缩,于术后2月、6月观测,对比之前逐渐缓解。免疫荧光检测BAMGgroup术后2周,1月替代段腔面偶见少量上皮细胞生长,6月腔面出现断续的上皮细胞爬行;Und-rASCs/BAMG group术后1月、2月替代段腔面单层的上皮细胞爬行,局部有连续性(通过BrdU示踪显示主要为植入未诱导脂肪干细胞),6月腔面形成单层上皮细胞,未见明显复层结构;Epith-rASCs/BAMG group术后1月、2月替代段腔面形成连续的单层上皮细胞爬行,局部出现复层上皮细胞(术后2月更为显著,通过BrdU示踪显示主要为植入诱导后脂肪干细胞)。　　4、结论：以上皮方向分化后脂肪干细胞复合BAMG进行兔模型尿道替代重建,术后通过尿道造影、免疫荧光等系列检测,证明对比单纯BAMG回植,及未诱导脂肪干细胞复合BAMG回植,能够在体内有效形成替代部位的上皮样结构,并一定程度上有助于尿道重建段的疤痕化挛缩及狭窄形成。实验证明通过体外诱导向上皮方向分化后的脂肪干细胞,能够作为尿路上皮细胞的替代种子细胞,应用于组织工程尿道重建的研究。