微生物作为全球物质能量循环的核心参与者,因其极为丰富的物种多样性、基因多样性、功能多样性及生态多样性,具有巨大的挖掘潜能。高通量测序技术的应运而生,极大地丰富了微生物生态研究手段,深化了我们对微生物群落结构组成的理解。然而,受技术限制,高通量测序结果中只有微生物分类及其相对丰度,不同分类水平微生物的绝对含量却不能获得。当样本间微生物总量变化较大时,以相对丰度表征不同样本间的微生物数量差异,可能会带来误差,甚至是相反的结论。据此,本研究针对目前高通量测序技术分析微生物群落结构存在的这一局限性,构建了 土壤细菌单域和古菌-细菌-真菌三域微生物群落结构的高通量绝对定量方法,实现了微生物跨样本、跨域的定量分析,更全面、深入地揭示了不同土壤中微生物群落结构特征及其交互作用。主要结果如下:(1)基于Escherichia coli O157:H7构建具备绿色荧光蛋白标记、氨苄青霉素抗性和特异性基因的细菌单域内标菌株HAAQ-GFP,采用平板计数法、显微镜计数法和实时荧光定量法对添加前与添加土壤后的单域内标菌株HAAQ-GFP进行定量,发现单域内标菌株HAAQ-GFP添加量为105-107cell g-1时,以添加前其显微镜计数结果,并在高通量测序数据分析时对16SrRNA基因拷贝数进行校正,所计算出的土壤细菌群落的绝对含量更为准确。供试土壤中细菌绝对总量为2.10×109±8.65×108cells g-1,细菌属水平浓度主要介于103.5-106.5cellsg-1,并服从偏对数正态分布。土壤中属水平浓度低于103cells g-1的细菌几乎未检测到,预测结果表明,土壤中仍有4.11-31.69%的细菌未被测得。(2)应用土壤细菌高通量绝对定量法揭示了紫砂土和母质紫砂岩、叠氮化钠抑菌处理土壤中细菌群落的动态变化,发现应用中相对丰度与绝对含量结果趋势截然相反的属分别占33.87%与40.58%,使用相对丰度和绝对含量比较跨样本间的细菌群落要比单凭相对丰度的更为准确。与母质相比,紫砂土中细菌整体呈现增长趋势,酸杆菌门与变形菌门中部分属的相对丰度与绝对含量均显著增长,表现出更好的适应能力和矿物分解能力。叠氮化钠对土壤细菌整体抑菌效果较好,细菌绝对总量显著降低,无细菌分类单元呈现出绝对含量显著增加的趋势,而厚壁菌门与放线菌门相对丰度增加,这与它们对叠氮化钠较为耐受、绝对含量降低较其他门的细菌少有关。(3)设计了集古菌和细菌16SrRNA基因片段、真菌ITS基因片段与自身特异性基因为一体的人工基因片段,通过全基因人工合成技术合成该片段并结合λ-Red基因编辑技术,将该人工合成片段同源重组敲入受体菌株Escherichia coli Dh5a染色体基因组中,构建了首个三域通用的内标菌株Escherichia coli WYL,使其可同时或分别作为原核(古菌、细菌)和真核(真菌)微生物群落结构高通量绝对定量的内标菌株,并首次验证和建立了土壤古菌-细菌-真菌三域微生物群落高通量绝对定量分析方法。(4)将三域微生物高通量绝对定量法应用于多环芳烃污染土壤中,基于三域微生物各分类水平绝对含量,揭示了土壤古菌、细菌与真菌群落结构对多环芳烃污染的响应。古菌多样性最低、绝对总量(107copies g-1)最少,仅占据整个土壤微生物群落的1%,古菌变化对整个微生物群落影响较小;细菌多样性高、数量(109copies g-1)占据整个微生物区系绝对总量的57.03-92.94%,主导了土壤微生物对多环芳烃污染的响应;而真菌多样性、绝对总量(108 copies g-1)及其响应均介于古菌与细菌之间。土壤古菌属水平绝对含量在103.5-106.5 copies g-1间呈不连续分布,细菌、真菌属水平绝对含量主要介于104-106.5 copies g-1、103.5-106 copies g-1,且细菌、真菌单域以及三域微生物整体的属水平绝对含量均服从偏对数正态分布。通过网络分析发现,长期多环芳烃污染下土壤三域微生物间细菌-细菌、细菌-真菌相互作用关系紧密,且互利关系(6635edges)多于竞争关系(1364edges),并趋向以降解功能菌群聚集。土壤古菌-细菌-真菌三域微生物群落高通量绝对定量的实现,突破了三域间跨域定量比较分析的瓶颈,使得高通量测序分析中跨域、跨样本比较更为精准,为微生物数量生态学提供了研究新方法与理论依据。