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第一部分全长及不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒的构建目的:构建全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒,为研究PAP抗HBV的活性区域奠定基础。方法:以含全长PAP基因的质粒PGEM-PAP为模板,设计3对引物,PCR扩增全长及不同片段缺失型PAP基因,TA克隆到pMD18-T载体中,经PCR、酶切、测序确证后,将它们用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,以正确读码框插入到经同样酶切的带有HA标签的真核表达载体pXF3H中,获得真核表达质粒pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34。以PCR和酶切方法筛选鉴定阳性重组质粒并测序验证。结果:构建的全长及不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒经酶切鉴定和DNA测序,表明各基因正确地插入到真核表达载体pXF3H中,且密码子阅读框正确。结论:成功地构建了全长和不同片段缺失型PAP基因的真核表达质粒。第二部分全长PAP基因真核表达质粒体外抑制HBV复制的研究目的:了解全长PAP基因真核表达质粒在DNA水平、RNA水平、蛋白质水平体外对HBV的抑制作用。方法:利用脂质体将全长PAP基因真核表达质粒pXF3H-PAP12和具有复制能力的1.3倍HBV克隆pHBV1.3共转染HepG2细胞,转染72h后收集细胞及培养上清。Southernblot检测HBV核衣壳相关DNA含量,Northern blot检测HBV核衣壳相关RNA含量,ELISA检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg含量。结果:与pXF3H空载体对照组相比,0.5ug/ml、1.0ug/ml pXF3H-PAP12质粒对HBV核衣壳相关DNA的抑制率分别为38.0%(P﹤0.01)、74.0%(P﹤0.01);对HBsAg的抑制率分别为76.8%(P﹤0.01)、99.7%(P﹤0.01),对HBeAg的抑制率分别为72.7%(P﹤0.01)、99.3%(P﹤0.01);1.0ug/ml pXF3H-PAP质粒对HBV核衣壳相关RNA的抑制率为69.0%(P﹤0.01)。结论:全长PAP基因真核表达质粒pXF3H-PAP12体外对HBV的病毒复制(DNA水平)和基因表达(RNA水平、蛋白质水平)均有抑制作用。第三部分天然PAP体内抑制HBV复制的研究目的:探讨天然PAP在急性HBV感染小鼠模型体内抗HBV的效果。方法:以液压法将具有复制能力的HBV质粒pAAV-HBV1.2通过尾静脉注射到免疫功能正常的BAL B/C小鼠体内,以建立急性HBV感染的小鼠模型。注射后第1天ELISA检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平,根据HBsAg和HBeAg水平将35只小鼠配对,分成PAP治疗组和对照组(每组12只)。PAP治疗组予0.25mg/kg的PAP(对照组予生理盐水)腹腔注射,每日一次,连续7天。于PAP注射前、注射第1、3、5、7天后,ELISA检测小鼠血清中HBsAg、HBeAg、抗HBs、抗HBe水平,荧光定量PCR检测小鼠血清中HBV DNA水平。注射第7天后HE染色检测肝组织病理变化,免疫组化检测肝组织HBsAg和HBcAg表达情况。结果:35只小鼠注射pAAV-HBV1.2后,有30只(85.7%)小鼠在注射后第1天血清中可检测到HBsAg,另5只小鼠血清中始终未检测到HBsAg。小鼠血清中HBsAg和HBeAg在第1天表达达高峰,之后逐渐下降,第8天均未能检测到。小鼠血清中HBV DNA在第2天达高峰,之后仍维持在较高水平,至第8天时为1.9×104 copies/mL。与腹腔注射生理盐水组相比,PAP在腹腔注射后第1、3、5天对HBsAg的抑制率分别为23%(P﹤0.05)、47%(P﹤0.05)、68%(P﹤0.05),对HBeAg的抑制率分别为36%(P﹤0.05)、55%(P﹤0.05)、83%(P﹤0.05);PAP在腹腔注射后第1、3、5、7天对HBV DNA的抑制率分别为70.7%(P﹤0.05)、86.9%(P﹤0.05)、95.2%(P﹤0.05)、95.3%(P﹤0.05),PAP也能抑制肝组织HBsAg和HBcAg的表达。结论:0.25mg/kg剂量的天然PAP在急性HBV感染小鼠模型体内对血清和肝组织的HBsAg、HBeAg的表达及HBV DNA的复制均有明显的抑制效果。第四部分全长及不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒体外抗HBV的研究目的:比较全长和不同片段缺失型PAP基因真核表达质粒体外抗HBV作用及其细胞毒作用。方法:将全长PAP基因、缺失C端25个氨基酸的PAP基因、既缺失N端69个氨基酸又缺失C端25个氨基酸的PAP基因的真核表达质粒用脂质体转染HepG2 2.2.15细胞,转染72h后收集细胞及培养上清。ELISA检测细胞培养上清液HBsAg和HBeAg水平,荧光定量PCR检测培养上清HBV DNA水平,MTT比色法检测各质粒对转染的HepG2细胞毒性作用。结果:与pXF3H空载体对照组相比,2.0μg/ml pXF3H-PAP12、pXF3H-PAP14、pXF3H-PAP34质粒对HBsAg的抑制率分别为61.39%(P﹤0.05)、56.3%(P﹤0.05)、7.8%(P﹥0.05),对HBeAg的抑制率分别为84.2%(P﹤0.05)、75.8%(P﹤0.05)、11.0%(P﹥0.05);对HBV DNA的抑制率分别为63.2%(P﹤0.05)、61.7%(P﹤0.05)、20.5%(P﹤0.05);MTT结果显示它们对细胞的抑制率分别为28.74%(P﹤0.05)、12.6%(P﹤0.05)、4.78%(P﹥0.05)。pXF3H-PAP14质粒对HBV的抑制作用与pXF3H-PAP12质粒相比无明显差异(P﹥0.05),但细胞毒性作用明显低于pXF3H-PAP12(P﹤0.05)。pXF3H-PAP34质粒无细胞毒性作用,但其抗HBV作用也丧失。结论:PAP的C端25个氨基酸与细胞毒性相关,与抗HBV活性无关;PAP的N端69个氨基酸与抗HBV活性相关。