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目的:大豆异黄酮是大豆等豆科植物在它们的生长过程中所产生的一类次级代谢产物,三羟异黄酮(Genistein,Gen)是大豆异黄酮的重要活性成分,具有多种生物学功能。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是存在于人和动物肝脏中的一种重要的Ⅱ相代谢酶,能够催化许多外源和内源化合物的代谢解毒。 本文通过细胞体外实验来研究Gen对肝细胞的保护作用,以及Gen对UGTs活性的影响及其作用机理,研究过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)在Gen诱导调控UGTs活性中的作用,为Gen保肝解毒及其对Ⅱ相代谢酶UGTs调控的机制提供依据。 方法:利用MTT法检测不同剂量Gen及PPAR激活剂分别对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的人正常肝细胞L-02及肝癌细胞HepG2、Hep3b活性的影响,研究Gen对正常肝细胞及癌细胞在APAP毒性诱导下的不同作用效果;利用高效液相色谱法研究 Gen、PPAR激活剂及抑制剂对 APAP在不同细胞内的代谢转化情况的影响,通过测定细胞培养液中APAP剩余量及细胞裂解液中葡萄糖醛酸化对乙酰氨基酚(APAP-GLu)生成量,对Gen及PPAR激活剂促进APAP代谢转化、保肝解毒的作用进行评价;以4-NP为底物,分光光度法检测Gen、PPAR激活剂及抑制剂分别对不同细胞 UGTs酶活性的影响;利用实时荧光定量 PCR法检测Gen及PPAR激活剂对三种细胞中UGT1A1、 UGT1A6、UGT1A9、UGT1A10及孤儿核受体PPARα、PPARγ的mRNA表达的影响,同时采用酶联免疫吸附试验对三种细胞中UGT1A、PPARα、PPARγ蛋白含量进行了测定,探究Gen调控UGTs活性的机理。 结果:(1)与空白对照组相比,Gen可以提高细胞对APAP毒性的抵抗能力,减轻APAP造成的损害;Gen处理或激活PPARs能够提高APAP在细胞内的葡萄糖醛酸化作用,促进其代谢转化;抑制PPARs的细胞环境不利于APAP的葡萄糖醛酸化反应;(2)Gen、PPARα激活剂、PPARγ激活剂能不同程度提高细胞UGTs活性,而PPARα抑制剂、PPARγ抑制剂会降低UGTs活性,其中PPARγ激活剂与抑制剂作用效果较小;(3)Gen、PPARα激活剂、PPARγ激活剂能不同程度提高细胞UGT1A1、 UGT1A6、UGT1A9及孤儿核受体PPARα、PPARγmRNA表达,同时增加细胞UGT1A、PPARα及PPARγ蛋白含量。 结论:Gen对APAP引起的细胞损害有一定的改善作用,这可能与Gen经由PPARs上调代谢APAP的主要II相代谢酶UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9等的表达,增加UGTs活性,从而促进APAP进行葡醛酸结合反应有关;激活PPARα能增加细胞UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9 mRNA的表达及UGT1A的蛋白含量,且Gen能一定程度上增加PPARα、PPARγ mRNA和蛋白表达,提示Gen可能通过激活肝脏PPAR(主要是PPARα)来调节UGTs活性与表达,促进外源化合物的代谢转化,达到保肝解毒的作用。