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研究背景:缺血再灌注损伤(IR)是指缺血状态的组织重新恢复血流引起的机体生理、生化和病理性改变,能够影响局部缺血组织的功能、诱发炎症反应和损伤远隔器官。肺是IR过程中最脆弱的远隔器官之一。肢体缺血再灌注损伤(LIR)诱导的急性肺损伤(ALI)是21世纪临床医生面临的常见问题。ALI是临床上十分常见的一类危重症,是由严重创伤、休克、酸中毒或严重感染等多种肺内外因素引起的,病死率高达40~31%,以炎症和血管通透性增加为特征,临床上表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫,发展至严重阶段被称为急性呼吸窘迫综合征。肺表面活性物质的不足和肺结构发育不成熟增加了肺对IR损伤的敏感性,而炎症和氧化应激有助于LIR诱导的ALI的病理过程。尽管ALI已被广泛探索几十年,但相关研究没有取得较大进展,ALI患者仍然需要面临长期的身体损伤。随着对ALI的认识在不断深入,大部分学者认为炎症风暴是ALI发生的关键因素。雷帕霉素(RAPA)是属于大环内酯类化合物的免疫抑制剂,通过抑制白细胞介素(IL)-2的表达从而阻碍T细胞及B细胞激活实现免疫抑制,被美国食品与药品管理局批准作为免疫抑制剂用于肾移植抗排异治疗和淋巴管肌瘤。大量研究证明RAPA不仅能抑制癌症进展,且在糖尿病、神经退行性疾病以及血液类疾病中疗效显著。总之,RAPA能缓解炎症,具有ALI治疗潜力。LncRNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA转录本,参与多种生理和病理过程。研究发现,lncRNA可能通过直接或间接调控焦亡相关蛋白进而调控各种疾病发生发展。LncRNA在LIR诱导的组织损伤中的研究已有报道,然而,lncRNA在LIR肺损伤中的调控机制还尚未清楚。第一部分RAPA通过抑制细胞焦亡保护LIR诱导的ALI研究目的:探究RAPA对LIR诱导的ALI动物模型的疗效和机制。研究方法:本实验以假手术组(sham组)为对照,构建LIR诱导的ALI大鼠模型(IR组),实验组使用RAPA进行预处理(IR RAPA组)。使用HE染色确定大鼠肺组织的病理学变化;试剂盒检测大鼠的SOD活性和MDA含量以评估抗氧化能力;免疫组化和westernblot检测焦亡标志因子NLRP3、caspase-1蛋白表达水平;ELISA检测炎症因子大鼠血清中IL-1β、IL-18的水平变化。研究结果:1.与IR组相比,IR RAPA组肺水肿、充血明显减轻,炎性细胞浸润减少,具有异型性的肺组织明显保留。2.与IR组相比,IR RAPA组显著逆转了由于IR处理导致的大鼠SOD活性、MDA水平、NLRP3和caspase-1蛋白水平以及1L-1β和1L-18含量的改变。第二部分大鼠LIR肺组织转录组测序分析研究目的:通过高通量测序筛选通过焦亡或损伤相关通路参与RAPA改善ALI进程的差异表达lncRNA和mRNA。研究方法:本实验模型组采用LIR诱导大鼠的ALI(IR组),实验组使用RAPA对LIR大鼠预处理(IR RAPA组),最后通过高通量测序表征两组大鼠的肺组织表达谱,以获得IR组和IR RAPA组肺组织中mRNA和lncRNA的差异表达特征。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析探究了差异表达的mRNA和lncRNA的富集情况;Miranda和RNAhybird软件对差异表达的mRNA和lncRNA与miRNA的关系进行预测,构建ceRNA调控关系。研究结果:1.IR组和IR RAPA组间总计鉴定到220个差异表达mRNA,与IR组相比,IR RAPA组有149个下调表达的mRNA和71个上调表达的mRNA。此外,鉴定到63个差异表达的lncRNA,与IR组相比,IR RAPA组有27个下调表达的lncRNA和36个上调表达的lncRNA。2.IR组和IR RAPA组间的差异表达mRNA及lncRNA主要参与IL-1的细胞反应、IL-6生物合成过程的正调控、中性粒细胞趋化性、细胞因子-细胞因子受体的相互作用以及细胞粘附分子等生物学过程和信号通路。3.IR组和IR RAPA组间的差异表达基因共得到1945条lncRNA-miRNAmRNA调控网络,表明存在差异表达lncRNA通过海绵吸附miRNA影响mRNA的表达对ALI的发生和治疗产生影响。4.lncRNALOC102553434和MMP9在IR组的表达量显著高于Sham组和IR RAPA组,且MMP9是LOC102553434/rno-miR-674-5p/MMP9轴的下游靶基因,因此,RAPA处理降低LOC102553434在ALI肺组织中的表达进而可能通过靶向rno-miR-674-5p/MMP9轴改善肺损伤。第三部分LOC102553434在肺泡上皮细胞损伤中功能研究研究目的:探究RAPA通过LOC102553434介导的ceRNA机制抑制细胞焦亡改善肺损伤中的作用机制。研究方法:本研究选取大鼠肺泡上皮细胞系进行体外实验,通过qRT-PCR检测Blank组、LPS组和LPS RAPA组中炎症因子(1L-1β、1L-18)以及LOC102553434、rno-miR-674-5p和MMP9的表达变化;利用siRNA干扰LOC102553434的表达,随后使用CCK-8鉴定细胞增殖能力;WB检测Blank组、LPS组、LPS RAPA si-NC组和LPS RAPA siRNA组中NRPL3、caspase-1以及MMP9的表达。研究结果:1.与LPS组相比,Blank和LPS RAPA组肺泡上皮细胞的1L-1β、1L-18、LOC102553434和MMP9表达显著下降,而rno-miR-674-5p的表达显著升高。2.干扰LOC102553434后,LPS siRNA组的肺泡上皮细胞的增殖能力明显较LPS组和LPS siRNA-NC组增强。3.与LPS组或LPS RAPA si-NC组相比,LPS RAPA siRNA组的肺泡上皮细胞中NRPL3、caspase-1以及MMP9蛋白表达显著降低。结论:1.RAPA通过抑制细胞焦亡保护LIR诱导的ALI。2.差异表达lncRNA通过海绵吸附miRNA调节mRNA的表达,参与LIR导致的大鼠ALI的病理过程,而RAPA通过调控lncRNA的表达从而达到治疗ALI的目的。3.LOC102553434可能通过作用于rno-miR-674-5p/MMP9轴参与肺泡上皮细胞损伤发生,有望成为ALI潜在的预防和治疗靶点。4.RAPA通过下调LOC102553434的表达进而下调MMP9的表达以及抑制焦亡相关分子的表达的双重抑制作用来减轻ALI,可能是ALI治疗的有效候选药物。