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目的1.通过分子生物学技术对腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)的改构以获得既能够特异性结合乙肝表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)又携带shRNA的重组病毒,为开发治疗HBV的靶向性试剂和药物奠定基础。2.研究肝脏去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor, ASGPR)大亚基异构体的生物学功能,为进一步以其为靶标的肝脏靶向治疗奠定基础。方法1.运用重组PCR技术将本室筛选得到的针对乙肝表面抗原的特异性多肽插入到2型腺相关病毒(AAV2)核衣壳蛋白的587位氨基酸处,同时将针对HBsAg的shRNA插入到AAV2的基因组。构建既携带shRNA又靶向HBsAg的重组AAV2病毒。2.运用磷酸钙共转染法包装重组的病毒,病毒经过纯化后,Real-Time PCR测定滴度。重组病毒按照一定的滴度感染HepG2、HepG2.215细胞,流式细胞仪检测感染效率。3.肝素封闭实验和HBsAb封闭实验验证重组病毒感染HepG2.215细胞的特异性,ELISA检测病毒对HBsAg、HBeAg的抑制。4.从正常人肝组织中克隆出ASGPR大亚基Hla、Hlb和小亚基H2c,构建EGFP融合表达质粒,荧光显微镜下观察大亚基Hla、Hlb和小亚基H2c的细胞定位。5.建立稳定表达ASGPRH1a、ASGPRH2c的功能性细胞系来研究ASGPR大亚基异构体H1b在ASGPR分子结合配体功能中的作用,同时研究sASGPR的生物学功能。结果1.成功构建了同时携带靶向HBsAg多肽和携带shRNA的重组AAV2,命名为rAAVssyU6-shRNA-hrGFP.纯化的病毒滴度在109v.g/ml以上。2. rAAVssyU6-shRNA-hrGFP对HepG2、HepG2.215细胞的感染率较AAV2明显升高,并且对HepG2.215细胞最为明显。并且可以抑制HepG2.215细胞HBsAg、HBeAg的表达。3.肝素封闭实验可以促进rAAVssyU6-shRNA-hrGFP病毒感染HepG2.215细胞,同时HBsAb封闭实验明显降低rAAVssyU6-shRNA-hrGFP病毒感染HepG2.215细胞。4.成功构建了EGFP融合表达质粒,EGFP-H1a主要在细胞膜表达；EGFP-H1b主要在细胞质内形成块状或颗粒状的聚集物；EGFP-H2c在细胞膜和细胞质内均匀分布。5.成功建立了表达ASGPR分子的功能性细胞系。并且ASGPR大亚基异构体H1b不影响ASGPR分子结合配体分子ASOR, sASGPR下调ASGPR分子结合配体的功能；sASGPR可以非特异性地和细胞结合,ASOR可以特异性上调sASGPR与细胞的结合。结论1. rAAVssyU6-shRNA-hrGFP对HepG2.215细胞的感染率明显升高,并且可以抑制HepG2.215细胞HBsAg、HBeAg的表达。2.rAAVssyU6-shRNA-hrGFP同时保留天然的趋向性和对HBsAg的靶向性。3.单独的ASGPR大亚基异构体H1b不影响ASGPR分子结合配体分子ASOR。4. sASGPR可以和ASOR分子形成复合物。sASGPR在维持体内糖基配体复合物代谢中发挥保护作用。当大量有害的糖基配体在外周血中出现时,sASGPR结合配体使其转运至肝脏代谢。本研究的创新点及意义1.首次构建了rAAVssyU6-shRNA-hrGFP病毒,并且该病毒在体外具有一定的靶向性和效应性。为靶向HBV的基因治疗提供了实验基础。2.首次探索了ASGPR大亚基异构体H1b及sASGPR在ASGPR结合配体功能中的作用。为系统了解ASGPR的生物学特性奠定了基础。