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目的 研究二次建立瑞芬太尼-切口痛模型大鼠痛敏行为学特点以及其脊髓背角神经元形态和电生理改变,初步证实疼痛记忆的形成并进一步探讨蛋白激酶Mζ(protein kinase Mζ,PKMζ)对驱动蛋白17(kinesin superfamily protein 17,KIF17)介导的含Glu A1亚基α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体转运在痛觉记忆中的调控机制。方法 第一部分选取2-3月龄健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠(240g-260g)56只,随机分为7组(n=8):C组(生理盐水组);I+I组(切口痛二次建模组)、R+R组(瑞芬太尼二次输注组);IR+NS组、IR+I组、IR+R组、IR+IR组则为首次建立瑞芬太尼-切口痛模型后第8天行二次建模,各组分别给予单纯输注生理盐水、切口痛、瑞芬太尼输注以及瑞芬太尼切口痛处理。各组于首次模型建立前24h,输注后2h、6h、1d、2d、3d、5d、7d,以及二次建模后2h、6h、1d、2d、3d、7d、14d、18d进行机械刺激缩足阈值(Paw withdrawal mechanical threshold,PWT)和热刺激缩足阈值(paw withdrawal thermal latency,PWL)检测。离体培养大鼠脊髓神经元,以4天为时间间隔给予瑞芬太尼孵育处理,应用微管相关蛋白2(Microtubule-associated protein-2,MAP2)标记神经元细胞并观察其形态变化,采用全细胞膜片钳技术检测AMPA受体介导的神经元自发活动。第二部分选取鞘内置管成功的2-3月龄健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠(240g-260g)随机分为5组:C+DMSO组(生理盐水+溶媒);C+Myr-RC-13组(生理盐水+溶于DMSO的小肽抑制剂);IR+IR+DMSO组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,并于一次建模后第二天以及二次建模前给予溶媒处理)、IR+IR+Myr-RC-13(2d)组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,并于一次建模后第二天给予小肽处理);IR+IR+Myr-RC-13(8d)组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,并于二次建模前给予小肽处理),各组于首次模型建立前2h,建模后2h、6h、1d、2d、3d、5d、7d,以及二次建模后2h、6h、1d、2d、3d、7d、14d、18d进行PWT和PWL检测,并根据对痛敏行为的缓解情况并结合临床可行性来确定最佳给药时间。于行为学检测后进行在体电生理实验,以评价C纤维到脊髓背角神经元突触传递效率改变;应用免疫印迹(Western Blot)检测KIF17、磷酸化KIF17、Glu A1-AMPA受体膜蛋白及总蛋白动态表达变化;蛋白质免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-Ip)检测KIF17与Glu A1亚基之间相互作用;免疫荧光检测脊髓背角KIF17表达变化以及KIF17与Glu A1共表达情况;高尔基染色检测脊髓背角神经元树突棘数量及形态改变。另选取鞘内置管成功的健康雄性SD大鼠,随机分为2组:C+NASPM组、IR+IR+NASPM组,并于首次模型建立前2h,建模后2h、6h、1d、2d、3d、5d、7d,以及二次建模后2h、6h、1d、2d、3d、7d、14d、18d进行PWT和PWL检测,在体电生理实验评价应用钙离子通透性AMPA受体的选择性抑制剂NASPM对C纤维到脊髓背角神经元突触传递效率的作用;Co-Ip检测NASPM对KIF17与Glu A1之间相互作用的影响。第三部分选取鞘内置管成功的2-3月龄健康雄性(Sprague Dawley)SD大鼠(240g-260g)随机分为8组:C+DMSO组(生理盐水+溶媒);C+ZIP组(生理盐水+溶于DMSO的ZIP);C+NPC-15437组(生理盐水+溶于DMSO的NPC-15437);IR+IR+DMSO组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,于一次建模后第二天、二次建模前以及二次建模后1天给予溶媒处理);IR+IR+ZIP(2d)组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,于一次建模后第二天给予ZIP处理);IR+IR+ZIP(8d)组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,于二次建模前即第8天给予ZIP处理);IR+IR+ZIP(9d)组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,于二次建模后1天即第9天给予ZIP处理);IR+IR+NPC-15437组(二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组,并于二次建模后1天给予NPC-15437处理)。各组于首次模型建立前2h,建模后2h、6h、1d、2d、3d、5d、7d,以及二次建模后2h、6h、1d、2d、3d、7d、14d、18d进行PWT和PWL检测;在体电生理实验于行为学检测后进行,以评价抑制PKMζ的活性对于二次建模大鼠C纤维到脊髓背角神经元突触传递效率的影响;高尔基染色检测ZIP对于二次建模大鼠脊髓背角神经元树突棘数目的影响;应用免疫印迹检测二次建模大鼠脊髓组织PKMζ、磷酸化PKMζ以及PKCι/λ动态表达变化;应用免疫印迹以及免疫荧光评价鞘内给予ZIP或者NPC-15437对于二次建模大鼠脊髓PKMζ、磷酸化PKMζ、PKCι/λ、KIF17、磷酸化KIF17、Glu A1-AMPA受体膜蛋白、Glu A1-AMPA受体膜总蛋白表达变化以及KIF17与Glu A1二者共表达的影响;Co-Ip检测鞘内给予ZIP对于二次建模大鼠脊髓KIF17与Glu R1之间相互作用的干扰。结果 第一部分在体行为学结果显示:与C组相比,I+I、R+R、IR+NS、IR+I、IR+R和IR+IR组的PWT和PWL值明显降低(P<0.01)。IR+IR组于首次建模后2天达到一次痛敏高峰,于二次建模后1天达到二次痛敏高峰,且二次痛敏高峰时点的PWT和PWL值明显低于一次痛敏高峰时点(P<0.01);IR+NS组单次造模后痛敏持续时间为8天,IR+IR组二次建模后痛敏持续时间长达至少14天。与一次痛敏高峰时点比较,I+I组二次痛敏高峰时点的PWT和PWL值明显降低(P<0.01),且痛敏持续时间延长,相同情况也见于R+R组。与IR+IR组比较,IR+I、IR+R组在二次痛敏高峰时点的PWT和PWL值明显升高(P<0.01)。离体实验结果显示:于首次孵育瑞芬太尼4天后二次给药,脊髓神经元树突分支数量较对照组增加(P<0.01);AMPA受体介导的自发兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)的频率和幅度增加(P<0.01)。第二部分结果1:行为学实验显示,鞘内给予小肽抑制剂Myr-RC-13对大鼠基础痛阈无影响(n=8,P>0.05);与C+DMSO组比较,IR+IR+DMSO组、IR+IR+Myr-RC-13(2d)组、IR+IR+Myr-RC-13(8d)组PWT和PWL值明显降低(n=8,P<0.01);与IR+IR+DMSO比较,IR+IR+Myr-RC-13组在给予Myr-RC-13后时点PWT和PWL值升高(n=8,P<0.01),且痛敏持续时间缩短;IR+IR+Myr-RC-13(2d)组和IR+IR+Myr-RC-13(8d)组在二次痛敏高峰及以后各时点PWT和PWL值无统计学差异(n=8,P>0.05)。结果2:Western Blot结果显示,与基础水平比较,二次建立瑞芬太尼-切口痛模型组大鼠脊髓KIF17、丝氨酸磷酸化KIF17表达上调(n=6,P<0.05),并于二次建模后1d达到高峰,持续时间至少14天,并于18天恢复至正常水平。Glu A1-AMPA受体膜蛋白及总蛋白表达上调(n=6,P<0.05),且膜蛋白/总蛋白比值升高(n=6,P<0.01);鞘内给予Myr-RC-13后,Glu A1-AMPA受体膜蛋白表达下调,膜蛋白/总蛋白比值下降(n=6,P<0.05)。免疫荧光结果显示:与C+DMSO组比较,IR+IR+DMSO组大鼠脊髓背角KIF17、Glu A1-AMPA受体以及二者共表达增加。结果3:高尔基染色结果显示IR+IR+DMSO组大鼠脊髓背角神经元树突棘数量增加(n=6,P<0.01),且可见蘑菇型树突棘;鞘内给予Myr-RC-13可下调二次建模大鼠脊髓背角神经元树突棘数量(n=6,P<0.01)。在体电生理结果显示IR+IR+DMSO组大鼠C纤维诱发电位长时程增强的形成,鞘内给予Myr-RC-13可减小二次建模大鼠群峰电位(population spike,PS)幅度(n=6,P<0.01)。结果4:Co-ip结果显示二次瑞芬太尼-切口痛模型建立大鼠脊髓KIF17与Glu A1-AMPA受体相互作用增强(n=6,P<0.05),而应用小肽抑制剂Myr-RC-13干扰KIF17功能(n=6,P<0.05)亦或鞘内给予NASPM(n=6,P<0.05)均可使这种相互作用减弱。此外,行为学结果显示,鞘内给予NASPM对大鼠基础痛阈无影响(n=8,P>0.05);与IR+IR+DMSO组比较,IR+IR+NASPM组在给予NASPM后时点PWT和PWL值升高(n=8,P<0.01),且痛敏持续时间缩短。在体电生理结果显示,与IR+IR+DMSO组比较,鞘内给予NASPM可减小二次建模大鼠PS波幅度(n=6,P<0.01)。第三部分结果1:行为学实验显示,鞘内给予PKMζ抑制剂ZIP10ng对大鼠基础痛阈无影响(n=8,P>0.05);与C+DMSO组比较,IR+IR+DMSO组、IR+IR+ZIP(2d)组、IR+IR+ZIP(8d)组、IR+IR+ZIP(9d)组的PWT和PWL值明显降低(n=8,P<0.01);与IR+IR+DMSO比较,IR+IR+ZIP组在给予ZIP后时点PWT和PWL值升高(n=8,P<0.01),且痛敏持续时间缩短。鞘内给予PKC抑制剂NPC-1543710nmol对大鼠基础痛阈无影响(n=8,P>0.05);与C+DMSO组比较,IR+IR+DMSO组、IR+IR+NPC-15437组的PWT和PWL值明显降低(n=8,P<0.01);与IR+IR+DMSO组比较,IR+IR+NPC-15437组在各时点PWT和PWL值无统计学差异(n=8,P>0.05)。Western Blot结果显示,与基础水平比较,二次建立瑞芬太尼-切口痛模型大鼠脊髓PKMζ、磷酸化PKMζ表达上调(n=6,P<0.05),并于二次建模后1d达到表达高峰,高峰可持续至二次建模后第7天,高表达持续时间至少14天。与基础水平比较,痛敏大鼠脊髓PKCι/λ在二次建立瑞芬太尼-切口痛模型后2h表达上调(n=6,P<0.05),且在二次建模后1d恢复至基线水平,以后各时点表达水平与基础水平无统计学差异(n=6,P>0.05)。高尔基染色结果显示与C+DMSO组比较,IR+IR+DMSO组和IR+IR+ZIP组大鼠脊髓背角神经元树突棘数量增加(n=6,P<0.01);与IR+IR+DMSO组比较,IR+IR+ZIP组大鼠脊髓背角神经元树突棘数量减少(n=6,P<0.01)。在体电生理结果显示鞘内给予ZIP可减小二次建立瑞芬太尼-切口痛模型大鼠PS波幅度(n=6,P<0.01)。结果2:Western Blot结果显示:二次建模前鞘内给予ZIP 10ng而非二次建模后第1天鞘内给予10nmol NPC-15437,可减轻由于二次建立瑞芬太尼-切口痛模型导致的脊髓组织中磷酸化PKMζ、KIF17(n=6,P<0.05)、Glu A1膜蛋白(n=6,P<0.05)以及总蛋白(n=6,P<0.05)的过表达情况;免疫荧光结果显示与IR+IR+DMSO组比较,IR+IR+ZIP组大鼠脊髓背角KIF17、Glu A1-AMPA受体二者共表达减少。免疫共沉淀结果表明与IR+IR+DMSO组比较,IR+IR+ZIP组脊髓KIF17与Glu A1-AMPA受体相互作用减弱(n=6,P<0.05)。结论:驱动蛋白17介导的Glu A1亚基-AMPA受体转运活动可在PKMζ而非PKCι/λ的调控下参与二次建立瑞芬太尼-切口痛模型大鼠疼痛记忆的发展过程。