昆虫体内神经肽分布广泛，参与调节几乎全部的生理过程，具有作为新型害虫控制剂作用靶标的潜力。桔小实蝇Bactrocera dorsalis（Hendel）（Diptera:Tephritidae）食性广泛，适应能力强，繁殖速度快，对世界果蔬产业造成的损失巨大。已有的研究表明，脂动激素（adipokinetic hormone，AKH）和corazonin（Crz）信号系统在昆虫体内具有重要的生理功能。因此，研究探索AKH和Crz信号系统在桔小实蝇体内的生理功能具有重要的科学意义，一方面有利于加深对昆虫神经肽保守性及功能多样性的认识，另一方面有助于揭示AKH和Crz信号系统作为桔小实蝇新型控制剂作用靶标的潜力。据此，本学位论文克隆桔小实蝇AKH和Crz及其受体基因（BdAKH和BdAKHR，BdCrz 和BdCrzR）的cDNA序列，明确其结构特征，并利用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞表达系统和胞内Ca2+流动测定的方法验证受体的功能性；采用qPCR技术解析BdAKH和BdCrz及其受体基因的时空表达模式，运用免疫组化技术定位表达AKH和Crz的神经元；最后，通过 RNA 干扰（RNAi）和行为学观察等技术解析上述两个信号系统对桔小实蝇幼虫生长发育和成虫交配行为的调控机制。本学位论文主要研究结果如下：　　1 桔小实蝇AKH、Crz及其受体cDNA的克隆与功能性表达　　基于桔小实蝇基因组和中枢神经系统（CNS）转录组数据，采用巢式PCR技术克隆获得桔小实蝇BdAKH和BdCrz前体基因及其相应受体基因的cDNA序列。BdAKH和BdCrz前体基因均具有神经肽保守的结构特征，即“信号肽+成熟肽+相关肽”，二者均只含有1个成熟肽，其中BdAKH成熟肽序列为QLTFSPDWamide， BdCrz成熟肽序列（QTFQYSHGWTSamide）在节肢动物中首次报道，为节肢动物Crz第8种亚型即[His7, Ser11]-Crz亚型。BdAKHR和BdCrzR均包含7个高度保守的跨膜结构域，为典型的G蛋白偶联受体（GPCR）。系统发育分析结果表明，节肢动物AKHR和CrzR聚为两个分支，其中，BdAKHR与刺舌蝇及黑腹果蝇AKHR亲缘关系最近，BdCrzR与黑腹果蝇及家蝇CrzR亲缘关系最近。　　利用CHO细胞异源表达系统，实现了桔小实蝇BdAKHR和BdCrzR的功能性表达，进一步采用胞内 Ca2+流动检测的方法，建立了两个受体的活性测定体系。AKH和Crz分别能够特异性且呈浓度依赖性地激活BdAKHR和BdCrzR。其中， BdAKH的EC50≈19.3 nM，BdCrz的EC50≈52.5 nM。交叉活性测定结果显示，桔小实蝇AKH和Crz信号系统不存在交互效应。因此，BdAKH为BdAKHR的内源性配体，BdCrz为BdCrzR的内源性配体。上述两个受体的功能性表达为后续开展生理功能及其控制剂靶标潜力研究奠定了基础。　　2 桔小实蝇AKH、Crz及其受体的表达分布　　采用qPCR技术解析桔小实蝇BdAKH、BdCrz及其受体的表达模式。结果表明，BdAKH和BdAKHR均在桔小实蝇成虫期高表达，幼虫期表达量次之，而在卵期和蛹期表达量相对较低，说明AKH信号系统可能在桔小实蝇成虫和幼虫期发挥重要功能。对成虫不同组织的qPCR分析结果显示，BdAKH主要在心侧体/咽侧体（corpora cardiaca/corpusallatum，CC/CA）高表达，而BdAKHR主要在脂肪体和中肠高表达。此外，免疫组化分析结果显示，桔小实蝇 AKH 主要在幼虫 CC/CA内高表达。　　BdCrz和BdCrzR在桔小实蝇各个发育阶段具有相似的表达模式，即均在幼虫期高表达，成虫期表达量次之，而在卵和蛹期表达量相对较低。对幼虫不同组织的qPCR分析结果显示，BdCrz主要在CNS高表达，BdCrzR则主要在气管和CNS高表达，并且在气管的Inka cell表达量最高。对成虫的不同组织分析发现，BdCrz同样在CNS高表达，而BdCrzR主要在脂肪体和CNS表达，并且在脂肪体的表达量最高。免疫组化分析结果显示，桔小实蝇幼虫脑叶的前脑背外侧区域（DL）有3对BdCrz神经元，腹神经索区域（VNC）有8对BdCrz神经元；在桔小实蝇成虫前脑背外侧区域（DLP）同样有 3 对 BdCrz 神经元。不同发育阶段差异性表达模式说明Crz信号系统可能在桔小实蝇成虫和幼虫体内分别承担不同的生理功能。　　3 桔小实蝇AKH信号系统的生理功能研究　　采用RNAi技术，研究AKH信号系统对桔小实蝇幼虫生长发育的调控作用，以及在不同营养条件下该信号系统对成虫脂质代谢、求偶、交配、产卵和飞行能力的影响。结果表明，干扰BdAKH基因的表达后桔小实蝇幼虫化蛹时间延迟；对幼虫注射 AKH 多肽后，其化蛹时间明显提前，且蛹重显著低于对照。说明 AKH信号系统参与调控桔小实蝇幼虫的生长发育过程。　　同样干扰BdAKHR基因的表达后，发现在饥饿或者饲喂条件下桔小实蝇腹部脂肪体颗粒变大且密集程度增加，甘油三酯含量显著升高。观察干扰 BdAKHR表达后桔小实蝇在正常饲喂、饥饿、先饥饿后饲喂（即食物拯救）三种营养条件下的交配行为，结果显示，在饥饿条件下雄虫的求偶率和交配率下降，其中交配率可以被饲喂食物拯救；雌虫的交配行为不受影响，但在饥饿条件下的产卵量显著下降。此外，吊飞试验结果表明，干扰 BdAKHR表达后在饥饿条件下雄虫的飞行能力显著下降，进一步说明AKH信号系统参与调控桔小实蝇成虫能量代谢。以上研究结果证明，AKH信号系统参与调控桔小实蝇的交配行为，且可能与该信号系统所具有的能量代谢调控作用有关。　　4 桔小实蝇Crz信号系统的生理功能研究　　采用RNAi技术，分析Crz信号系统对桔小实蝇幼虫-蛹变态发育过程的调控作用以及对成虫交配行为的影响。结果表明，干扰BdCrzR的表达导致幼虫化蛹时间显著延迟（约 72 h），同时引起蜕皮和黑化相关基因表达量下调，包括蜕皮启动激素（ecdysis-triggering hormone，ETH）、酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）和多巴脱羧酶（dopa-decarboxylase，DDC）基因。说明干扰 BdCrzR 的表达可能导致多巴胺合成通路受阻，进而引起蛹的形成和表皮黑化过程异常。进一步通过幼虫前端结扎和注射多肽分析发现，对幼虫前端结扎能有效阻断 Crz 由中枢神经系统向后端的传输，幼虫前端出现蛹的特征而后端无法正常化蛹，而对后端注射Crz或ETH多肽后，幼虫后端均能恢复化蛹。说明Crz信号系统位于ETH、TH和DDC信号系统上游，调控桔小实蝇幼虫-蛹的生理转化过程以及蛹的形成。　　在桔小实蝇成虫期，干扰雄虫 BdCrz 基因的表达后，其与正常雌虫的交配时间显著延长，干扰雄虫BdCrz或BdCrzR的表达均导致交配后雌虫产卵量下降，但均不影响雄虫的求偶行为和交配率。为进一步分析干扰BdCrz或BdCrzR的表达导致产卵量下降的原因，采用DAPI染色法观察发现交配后雌虫受精囊内精细胞数量显著减少，说明干扰BdCrz或BdCrzR的表达可能导致雄虫精细胞转移受阻，进而导致雌虫产卵量下降。　　综上所述，本学位论文研究阐释了AKH和Crz两个信号系统在桔小实蝇体内承担的生理功能，即 AKH 信号系统通过能量代谢调控功能，影响幼虫生长发育、成虫交配行为以及飞行能力等耗能相关生理活动；Crz 信号系统调控幼虫-蛹的转化以及化蛹，并且对桔小实蝇交配时长和产卵量有显著影响，该结果为昆虫蛹的形成机制提供了全新的认识，同时也说明该信号系统参与调控桔小实蝇雄虫交配及生殖行为。AKH和Crz信号系统具有研发成为新型害虫行为调节剂靶标的潜力。