第一部分：锰对体外培养耳蜗毛细胞以及螺旋神经节细胞的损伤研究　　目的:通过大鼠耳蜗器官体外培养技术，观察耳蜗器官在离体培养条件下锰暴露对耳蜗毛细胞、听觉神经纤维、螺旋神经节细胞的损伤作用。通过特异性荧光染色观察锰诱导耳蜗器官损伤过程中细胞内ROS水平的变化及细胞凋亡在锰诱导耳毒性中的调控作用，为进一步探究锰诱导耳毒性的分子机制提供理论依据。　　方法：将出生3天的新生Sprague Dawley大鼠的耳蜗器官体外培养，将贮存浓度为100mM的氯化锰用SFM稀释到终浓度为1mM，3mM，5mM，体外染毒处理耳蜗基底膜。应用鬼笔环肽染色特异性显示耳蜗毛细胞的静纤毛，同时用免疫荧光染色的方法对听觉神经纤维和螺旋神经节细胞进行标记，TUNEL试剂盒、Cleaved caspase-3抗体、MitoSOX Red对耳蜗基底膜进行染色，在激光共聚焦显微镜下分别观察耳蜗基底膜的毛细胞，听觉神经纤维和螺旋神经节细胞的形态学变化。　　结果：　　①耳蜗基底膜培养24、48小时，1mM氯化锰对耳蜗毛细胞及听觉神经纤维损伤甚微，差异无统计学意义（p＞0.05），内、外毛细胞排列整齐规律，听神经纤维分布均匀，成束排列。　　②最高浓度5mM氯化锰处理24、48小时后对听觉神经纤维造成明显的损害，与对照组相比，差异有统计学意义（p＜0.05）。　　③2mM氯化锰处理，对耳蜗基底膜底转毛细胞、神经纤维损伤较中转、顶转明显。　　④不同浓度氯化锰处理24小时HC、SGNs中TUNEL染色阳性细胞随着氯化锰浓度的增加而增多。　　⑤不同浓度氯化锰处理24小时HC、SGNs中Cleaved caspase-3染色阳性细胞亦随着氯化锰浓度的增加而增多。　　⑥不同浓度氯化锰培养8小时，HC中MitoSOX Red免疫荧光强度随着氯化锰浓度的增加而增强。　　⑦锰对毛细胞、神经纤维、螺旋神经节细胞会造成明显的损伤。锰会造成毛细胞缺失，神经纤维变细变少，螺旋神经节细胞数量减少，皱缩，凋亡，并与剂量和接触时长呈正相关。　　结论：通过大鼠耳蜗器官体外培养技术，证实锰对毛细胞、神经纤维和螺旋神经节细胞会造成明显的损伤。细胞凋亡及氧化应激损伤可能是锰诱导耳毒性的损伤机制，锰有可能与铅，镉，汞同样列为与听力下降或耳蜗病理相关的重金属。　　第二部分：NAC对锰诱导耳毒性保护作用研究　　目的:NAC是线粒体电子传递链中的辅酶。NAC对神经轴索损伤可起到保护作用，通过对大鼠耳蜗器官体外培养，探讨NAC对锰诱导耳毒性的保护作用。　　方法：将出生3天的新生Sprague Dawley大鼠的耳蜗器官体外培养，取SD新生大鼠耳蜗，分为4组，第一组：正常对照组；第二组：对照组+NAC组；第三组：氯化锰处理组；第四组：氯化锰处理+NAC组；应用鬼笔环肽特异性标记耳蜗毛细胞的静纤毛，应用Parvalbumin抗体特异性标记毛细胞胞浆，同时用免疫组织化学的方法对听神经纤维和螺旋神经节细胞进行染色，用TUNEL试剂盒、Cleaved caspase-3抗体、MitoSOX Red对耳蜗基底膜进行染色，在激光共聚焦显微镜下分别观察耳蜗基底膜的毛细胞，神经纤维，螺旋神经节细胞。　　结果：　　①0.5mM氯化锰染毒处理培养72小时后，顶转，中转毛细胞及神经纤维损伤轻微，NAC保护作用表现不够明显，而底转毛细胞，神经纤维损伤严重，NAC对底转毛细胞及神经纤维具有很好的保护作用。　　②1mM氯化锰染毒处理培养24小时，NAC干预后HC、SGNs中 C-caspase3免疫荧光组织化学染色阳性细胞数减少。　　③1mM氯化锰染毒处理培养24小时，NAC干预后SGNs中TUNEL染色阳性细胞数减少。　　④1mM氯化锰染毒处理培养8小时，NAC干预后毛细胞MitoSOX Red免疫荧光强度减弱。　　结论：NAC对锰诱导体外培养耳蜗毛细胞、听神经纤维、螺旋神经节细胞损伤具有明显的保护作用，NAC能够减少锰诱导HC、SGNs中TUNEL染色、C-caspase3染色阳性细胞数，抑制线粒体内氧化应激损伤，保护细胞内线粒体结构和功能，阐明了NAC可能通过抑制线粒体内氧化应激损伤，从而抑制DNA损伤及细胞凋亡发挥对听觉细胞的保护作用。