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1研究背景及目的近年来,城市化及老龄化进程加快,同时伴随着生活方式的改变,肥胖和超重人口增加,与之相关的2型糖尿病的发病率逐年增高。根据IDF(国际糖尿病联盟)统计,2015年中国糖尿病患病人数于高达1.096亿人,其中130万人死于糖尿病及其并发症。因此,预防和治疗2型糖尿病是人类健康及国民经济社会发展中迫切需要解决的问题。2型糖尿病作为一种慢性代谢性疾病,发病机制复杂,涉及遗传、免疫炎症、氧化应激、肠道微生物等多种因素,但最终以胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能受损为切入点,引发机体糖脂代谢紊乱,造成一系列并发症。胰岛素抵抗是2型糖尿病的早期病理改变,肥胖与胰岛素抵抗、血脂紊乱、动脉粥样硬化等多种代谢综合症的发生密切相关,慢性低度炎症反应被认为是联系肥胖和2型糖尿病的关键环节。肥胖患者脂肪组织中高达40%的细胞为巨噬细胞,在肥胖脂肪组织巨噬细胞中可观察到炎症通路高度活化,及其导致的各种炎症因子的过度释放,如TNF-a和IL-6,这些促炎因子既可以以旁分泌的方式在局部发挥作用,也可以离开脂肪组织进入到循环中作用于其他胰岛素靶器官降低胰岛素敏感性,如肝脏、肌肉、胰腺、下丘脑等。其中炎症信号通路的激活和炎症因子的分泌是介导胰岛素抵抗发生的关键关节。TLR4/My D88信号通路调节体内天然免疫和获得性免疫应答,在感染、炎症性疾病、自身免疫疾病中发挥重要作用。近年来研究发现,此信号通路与胰岛素抵的发生密切相关,并且证实TLR4/My D88信号途径通过激活NFk B调控炎症因子IL-23的合成,因此可以将IL-23视为TLR4/My D88通路的下游炎症因子。IL-23与糖尿病的联系的研究多集中在1型糖尿病患者,已有证据显示IL-23参与胰岛细胞的免疫反应,导致1型糖尿病的发生。但对IL-23与2型糖尿病之间关系知之较少。因此本实验将探究TLR4/My D88信号通路及其下游炎症因子IL-23与2型糖尿病之间的关系,阐述其机制。二甲双胍是治疗2型糖尿病的一线用药,其降糖机制主要在于抑制肝糖原的输出及提高周围器官组织对胰岛素利用的敏感性,其在分子水平上的作用机制为AMPK依赖途径和不依赖AMPK的独立途径。而多项研究证明,二甲双胍具有一定的抗炎活性,本实验将以TLR4/My D88/IL-23信号通路为切入点,详细探究二甲双胍的抗炎机制。2材料和方法2.1分组、饲喂及取材SPF级SD雄性大鼠40只(89.62±7.42g,河南省中医药研究院研究中心),适应性喂养7天后随机分为4组:正常饮食组(NC组),造模组(DM组),造模并注射胰岛素(DM+INS组),造模并灌胃二甲双胍(DM+MET组)。造模方法为高脂高糖饮食并联合腹腔注射STZ(30mg/kg)。MET按200mg/kg灌胃,不给予MET大鼠予生理盐水灌胃,胰岛素应用甘精胰岛素,使用剂量根据预实验经验注射。于12周末处死大鼠,空腹状态下腹主动脉取血,离心取上层血清,分离取骨骼肌组织,置于-80℃冰箱中冻存。2.2观察指标葡萄糖氧化酶法测空腹血糖(FBG,单位mmol/L),电化学发光法测空腹胰岛素(FINS,单位u IU/L),计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FBG×FINS/22.5;ELISA法检测血清中IL-23的表达水平;Western blotting测骨骼肌AMPK、TLR4、My D88及NFκB蛋白含量;RT-PCR检测骨骼肌TLR4-m RNA及My D88-m RNA含量;免疫荧光观察骨骼肌中IL-23的表达。3结果3.1 HOMA-IR各组大鼠HOMA-IR之间差异有统计学意义(F=586.168,P<0.05)。与NC组相比,DM组HOMA-IR增加(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组HOMA-IR无明显差异(P>0.05),DM+MET组HOMA-IR显著下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组HOMA-IR下降(P<0.05)。3.2血清IL-23的表达水平各组大鼠血清IL-23表达水平差异有统计学意义(F=37.941,P<0.05)。与NC组相比,DM组IL-23表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组的IL-23表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的IL-23表达明显下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组IL-23表达下降(P<0.05)。3.3大鼠HOMA-IR与IL-23水平的相关性分析DM组,HOMA-IR与血清IL-23呈正相关,r=0.716,P<0.05;DM+MET组,HOMA-IR与血清IL-23呈正相关,r=0.725,P<0.05。3.4大鼠骨骼肌组织TLR4-m RNA、My D88-m RNA的表达水平各组大鼠骨骼肌组织TLR4-m RNA水平差异有统计学意义(F=37.458,P<0.05)。与NC组相比,DM组TLR4-m RNA表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组TLR4-m RNA表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的TLR4-m RNA表达明显下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组TLR4-m RNA表达下降(P<0.05)。各组大鼠骨骼肌组织My D88-m RNA表达差异有统计学意义(F=45.599,P<0.05)。与NC组相比,DM组My D88-m RNA表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组My D88-m RNA表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的My D88-m RNA表达明显下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组My D88-m RNA表达下降(P<0.05)。3.5大鼠骨骼肌组织AMPK的表达水平各组大鼠骨骼肌组织AMPK表达差异有统计学意义(F=69.920,P<0.05)。DM+MET组AMPK表达较NC组、DM组、DM+INS组均升高(P<0.05);NC组、DM组、DM+INS组三组间AMPK表达差异无统计学意义(P>0.05)。3.6骨骼肌组织中TLR4、My D88、NFκB的表达水平各组大鼠骨骼肌组织TLR4表达差异有统计学意义(F=94.836,P<0.05)。与NC组相比,DM组TLR4表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组TLR4表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的TLR4表达下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组TLR4表达下降(P<0.05)。各组大鼠骨骼肌组织My D88表达差异有统计学意义(F=131.266,P<0.05)。与NC组相比,DM组My D88表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组My D88表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的My D88表达下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组My D88-m RNA表达下降(P<0.05)。各组大鼠骨骼肌组织NFκB表达差异有统计学差异(F=176.829,P<0.05)。与NC组相比,DM组NFκB表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组NFκB表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的NFκB表达下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组NFκB表达下降(P<0.05)。3.7大鼠骨骼肌IL-23的表达水平各组大鼠骨骼肌IL-23的表达差异有统计学意义(F=37.274,P<0.05)。与NC组相比,DM组骨骼肌IL-23表达升高(P<0.05);与DM组相比,DM+INS组的骨骼肌IL-23表达稍下降(P<0.05),DM+MET组的骨骼肌IL-23表达明显下降(P<0.05);与DM+INS组相比,DM+MET组骨骼肌IL-23表达下降(P<0.05)。4结论4.1 2型糖尿病大鼠血清及骨骼肌IL-23表达水平升高。4.2炎症因子IL-23与2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗相关。4.3 2型糖尿病大鼠骨骼肌TLR4/My D88信号通路激活。4.4二甲双胍通过激活AMPK抑制骨骼肌TLR4/My D88信号通路,进一步抑制下游炎症因子IL-23的表达,直接或间接改善胰岛素抵抗。